不同地区和作物上根结线虫群体is片段的比较

不同地区和作物上根结线虫群体is片段的比较

根结线虫是一种非常重要的植物致病性线虫，广泛分布于世界各地。在热带和亚热带雨量充沛、气候温和的地区,根结线虫的危害甚至比孢囊线虫(Heterodera和Globodera)更为严重。迄今已知道的根结线虫对植物造成危害的超过3000种,经常使寄生的多种植物和经济农作物受到侵害,造成重大的经济损失。同一类群的植物寄生线虫种间具有很多相似的特征,种内群体因生态条件的差异有明显的生理分化现象,存在不同的生理小种或致病型,同一种线虫因生理小种或致病型的差异对特定作物品种的危害程度差别很大。因而,采取可靠的分类鉴定方法是植物线虫病害防治的基础。自20世纪80年代中期以来,利用分子生物学技术和方法直接检测植物线虫种间和种内群体在遗传组成上的根本差异,以揭示线虫发育的进化关系的研究也日趋增多。利用根结线虫基因组DNA和线粒体DNA的AFLP指纹以及根结线虫rDNA-ITS-PCR-RFLP分析可以对不同的根结线虫进行分类和鉴定。国外学者对奇特伍德根结线虫(Meloidogynechitwoodi)和法拉克斯根结线虫(M.fallax)的基因组DNA进行AFLP分析后,发现奇特伍德根结线虫和法拉克斯根结线虫在种内都存在遗传多样性,而且奇特伍德根结线虫种内的多样性要高于法拉克斯根结线虫。另外,有的国外学者用引物5S和引物18S扩增爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)、南方根结线虫(M.incognita)、玛雅圭根结线虫(M.mayaguensis)和北方根结线虫(M.hapla)的rDNA中18S和5S之间的内转录间隔区域(internaltranscribedspaceregion,ITS),从爪哇根结线虫、花生根结线虫和南方根结线虫中扩增出715bp的ITS产物,从玛雅圭根结线虫中扩增出831bp的ITS产物,从北方根结线虫中扩增出的ITS最小,仅为564bp,从而有效地揭示了种内和种间变异。还有的国外学者用通用引物5367、5368、F194和F195扩增奇特伍德根结线虫、法拉克斯根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、纳西根结线虫(M.naasi)群体的rDNA-ITS区,均得到1条大小约760~800bp的片段,然后用17种限制性内切酶酶切扩增产物;用RFLP技术分析了不同种的多态性片段,并用RAPD技术构建了这些种的遗传距离图,有效揭示了根结线虫种间变异。彭德良等用PCR技术对来自中国的10个根结线虫群体进行rDNA-ITS-RFLP及其序列的研究,应用通用引物F195和V5367扩增出1条约700bp的DNA片段,并结合形态学特征和形态测量值将这些群体诊断为4个常见种和象耳豆根结线虫(M.entrolodii)。廖金铃等对广东、海南和福建等地的根结线虫rDNA的ITS区进行了研究,通过对荧光AFLP片段分析和对18S基因组、ITS区和26S基因组的扩增、克隆和测序分析,成功鉴定出花生根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫和描述的1个新种番禺根结线虫(M.panyuensis)。赵鸿等2003年应用3种限制性内切酶酶切各地根结线虫rDNA-ITS的扩增产物,成功的区分出各地根结线虫。RAPD技术也可以从整个基因组DNA筛选与某一性状相连锁的DNA标记。由于RAPD容易检测出DNA的多态性,通过RAPD可以鉴定植物线虫的不同属种及种下群体。RAPD分析已成功的用于4种常见根结线虫:南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和爪哇根结线虫的鉴定和鉴别。通过对不同类群线虫及其种和种下群体的RAPD,获得的多态性资料进行分析,可以了解它们彼此DNA的同源程度,从而确定彼此的亲缘关系和进化地位。喻盛甫等用120个随机引物对南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和爪哇根结线虫等4种常见根结线虫10个小种和类型的全基因组DNA进行了RAPD分析,表明4种根结线虫种及小种扩增的谱型有明显的特异性。笔者以rDNA-ITS作为根结线虫1个遗传标记,通过PCR扩增寻找根结线虫该序列的特异性片段,对PCR产物进行克隆测序分析不同根结线虫在该序列的同源性和亲缘关系,旨在为根结线虫遗传多样性研究提供理论依据。1材料和方法1.1试验昆虫的来源供试根结线虫均由中国农业科学院植物保护研究所采集和保存,其编号和来源见表1。1.2蛋白酶变性试验从新鲜的植物根结组织中挑取单头根结线虫的雌虫,放入盛有10μL灭菌重蒸水的PCR管中,并用解剖针将其刺破。加入8μL预冷的WLB(蠕虫裂解液)和2μL蛋白酶K(1mg/mL),13200r/min离心0.5min。迅速放入-20℃冰箱中至少10min。然后分别在65℃下温育1.5h以降解核糖核酸,95℃下10min,使多余的蛋白变性。最后在13200r/min下离心1min,吸取上层DNA清液于PCR管中,-20℃保存备用。1.3pcr检测根结线虫总dna用Vrain设计的线虫ITS扩增的通用引物进行PCR扩增,50μL反应体系。10×PCRBuffer(Mg2+Plus)5μL,dNTPMixture4μL,Taq酶(5U/μL)0.4μL,引物26S(20μmol/L)1.5μL,引物V5367(20μmol/L)1.5μL,模板DNA5μL,加ddH2O至50μL。所用引物的序列如下:V5367:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′(上游),26S:5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′(下游)。PCR扩增以根结线虫的总DNA为模板,反应条件:94℃预变性5min,然后94℃1min,55℃1.5min,72℃2min,循环35次;最后72℃延伸10min。4℃保存备用。PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶110V电泳30min进行检测,用0.5×TAE作为电泳缓冲液,并在紫外灯下观测照相。1.4pcr产品的恢复PCR产物采用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化,具体操作步骤参照试剂盒操作说明。1.5发酵剂lidh5atg将纯化后的PCR产物与PGEM-TEasyVector在4℃下连接12~16h,采用热击法转化到通过CaCl2法制备的E.coliDH5a感受态细胞(TIANGEN公司)中。在含有Ampicillin(100mg/L),IPTG(24mg/L)和X-gal(200mg/L)的LB筛选平板上挑取单个白色菌落于含有Ampicillin(100mg/L)的液体LB中摇培过夜。采用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒提取重组质粒DNA,经PCR鉴定后,筛选出含有正确插入片段的重组克隆送上海生工生物工程有限公司进行序列测序。1.6序列分析和同源性比较采用DNAMAN软件对所测定的序列进行比对分析,找出各不同地区根结线虫ITS序列的同源性以及其亲缘关系和遗传距离。2结果与分析2.1海南胡椒上根结线虫片段的大小根结线虫的总DNA经PCR扩增后,除海南胡椒上根结线虫的ITS片段大小为869bp之外,其它根结线虫ITS片段均为766~772bp(图1)。2.2价值补充酶切开剂的测定结果重组质粒经过酶切后都得到1个与相应ITS片段大小约同的片段(图2)。这说明质粒的提取非常成功,是ITS片段PCR扩增产物的重组克隆。2.3预防3个供试根结线虫品长度对所测定的序列进行比对分析后,其结果表明,RKN-1、RKN-2、RKN-3、RKN-4、RKN-5、RKN-6、RKN-7和RKN-8等8个供试根结线虫样品ITS扩增产物的长度为768bp;RKN-9、RKN-10、RKN-11和RKN-16等4个供试根结线虫样品ITS扩增产物的长度为769bp;RKN-12供试根结线虫样品ITS扩增产物的长度为767bp;RKN-13供试根结线虫样品ITS扩增产物的长度为772bp;RKN-14供试根结线虫样品ITS扩增产物的长度为869bp;RKN-15供试根结线虫样品ITS扩增产物的长度为776bp。供试16个不同种群根结线虫ITS序列的聚类分析结果见图3。3orpse-pcr扩增检测根结线虫扩增根结线虫的分类和鉴定是从事根结线虫一切研究的前提和基础。随着我国农业产业结构的调整,农业正在向优质高效和集约化规模化方向发展,高附加值的经济作物种植面积的比重逐年上升,复种指数增加使得根结线虫的发生危害有逐年加重的趋势。在田间,危害农作物的根结线虫往往是3~4种混合发生,根结线虫的新寄主和新的种类的不断发现使得常规形态学鉴定和诊断变得越来越困难,这就需要其它的方法来对根结线虫进行分类鉴定。随着分子生物学技术的发展,采用PCR方法对根结线虫某段具有种特异性的DNA进行序列分析,为根结线虫的鉴定和分类提供了行之有效的方法。目前,PCR技术在寄生虫学领域已得到日益广泛和深入的应用,尤其是近几年来用于寄生虫分子分类学和分子遗传学等方面的研究已取得了很大的成功。PCR技术用于寄生虫分子分类学的研究中,选择合适的靶序列至关重要。ITS是核糖体DNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区,包括ITS-1和ITS-2两段序列,它们在生物进化过程中显示种的特征,在种内具有高度保守性,在不同种间又有不同程度的变异,是最广泛应用于寄生虫种间分类鉴定的理想遗传标记。本研究对根结线虫的ITS序列进行了测定与比对分析,发现我国农作物和蔬菜上的根结线虫主要还是4种常见的根结线虫:南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫,但是在海南安定县还是存在特殊的根结线虫种类(番禺根结线虫),它的ITS区域与其它根结线虫有明显的不同。通过对这16个根结线虫样品ITS序列进行比对和聚类分析,发现北京密云的苦瓜和豇豆,北京通州月季和山东3个地区花生上的根结线虫都属于北方根结线虫;云南番茄、成都黄瓜和海南石榴上的根结线虫则属于爪哇根结线虫;河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黄瓜上的根结线虫则属于花生根结线虫;而安徽宿州和和县番茄以及太和桔梗上根结线虫则属于南方根结线虫;唯一1个不属于4种常见根结线虫的样品是海南胡椒上的根结线虫。通过序列比对分析,发现它与番禺根结线虫的同源性达到97%。由此可见它属于番禺根结线虫。廖金铃教授曾经克隆和测定了福建、广东和海南等地区的根结线虫的ITS序列,首次发现和报道了番禺根结线虫,并向NCBI提交了番禺根结线虫的ITS序列(AY394719)。通过对根结线虫ITS序列的克隆与测序,不仅可为我国各地和各种作物上的根结线虫遗传多样性积