生物化学(Biochemistry)是研究生命化学的科学

绪论

生物化学（Biochemistry）是研究生命化学的科学，它在分子水平探讨生命的本质，即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节及其在生命活动中的作用。生物化学是医学生必修的基础医学课程，为学习其它基础医学和临床医学课程、在分子水平上认识病因和发病机理、诊断和防止疾病奠定扎实的基础。当今生物化学越来越多的成为生命科学的共同语言，它已成为生命科学领域的前沿学科。

一、基本内容和重点

本课程主要介绍以下几方面内容：

（1）生物大分子（包括蛋白质、酶及核酸等）的分子结构、主要理化性质，并在分子水平上阐述其结构与功能的关系；

（2）物质代谢（包括糖类、脂类及蛋白质）的代谢变化，重点阐述主要代谢途径、生物氧化与能量转换、代谢途径间的联系以及代谢调节原理及规律；

（3）阐明遗传学中心法则所揭示的信息流向，包括DNA复制、RNA转录、翻译及基因表达调控；

（4）概要地介绍重组DNA和基因工程技术及其与医学应用的联系；

（5）概要地介绍细胞信息传递及其途径。

二、学习方法本课程的一个特点是各章节之间联系紧密，与其它学科也有很大联系。因此，在学习过程中必须加强相关章节、相关学科知识的学习，特别是必须在学好有机化学、生物学等学科的基础上，才能较好理解生物化学的有关内容；另一个特点是内容较抽象，自学难度较大，必须进行课前预习，充分利用老师的课堂讲授理解所学的内容，课后及时复习，一定的习题练习也有助于理论知识的理解。蛋白质的结构与功能第二章StructureandFunctionofProtein本章主要内容蛋白质的分子组成蛋白质的分子结构蛋白质结构与功能的关系蛋白质的理化性质与分离纯化一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递2.蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质的分子组成

TheMolecularComponentofProtein第一节

组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘

。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%

蛋白质元素组成的特点一、氨基酸

——组成蛋白质的基本单位存在于自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种。这些氨基酸中，大部分属于L-

-氨基酸。其中，脯氨酸属于L-

-亚氨基酸，而甘氨酸则属于

-氨基酸。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R蛋白质的基本单位——L-

-氨基酸或L-

-氨基酸的结构通式(投影式)

与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸。丙氨酸的两种立体异构体构型：分子中各原子或基团之间的连接方式称为分子的构型。组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。(1)按侧链R基的结构（一）氨基酸的分类(2)按侧链R基的极性非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucine

LeuL

5.98异亮氨酸

isoleucine

IleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水性氨基酸色氨酸

tryptophan

TrpW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTyrY

5.66

半胱氨酸

cysteine

CysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagine

AsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonine

ThrT5.602.极性中性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginine

ArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸甘氨酸（Gly）无光学活性几种特殊氨基酸脯氨酸Pro

（亚氨基酸）

半胱氨酸Cys

+胱氨酸二硫键-HH苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr

和色氨酸Trp蛋白质分子中Phe,Tyr和Trp残基的存在使得蛋白质在近紫外区(220-300nm)有特征性吸收＊苯丙氨酸的max＝257nm酪氨酸的

max＝275nm色氨酸的max＝280nm（二）氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。等电点(isoelectricpoint,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸在280nm波长处具有特异性吸收峰。由于大多数蛋白质含有这些氨基酸残基，故通过测量280nm波长的紫外吸光度可对蛋白质溶液进行定量分析。芳香族氨基酸的紫外吸收3.茚三酮反应（氨基酸呈色反应）氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。二、肽*

肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的

-羧基与另一个氨基酸的

-氨基脱水缩合而形成的化学键。（一）肽(peptide)*

肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*

两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*

肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*

由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽。*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽键为共价键，具有部分双键性质，不能自由旋转。参与肽键组成的6个原子C

1、C、O、N、H、C

2位于同一平面，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元（酰氨平面）。多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以

碳原子相隔。多肽与蛋白质蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。

通常在多肽链的一端含有一个游离的

-氨基，称为氨基末端或N末端；在另一端含有一个游离的

-羧基，称为羧基末端或C末端。肽链的N末端与C末端：氨基酸顺序：氨基酸的顺序是从N末端的氨基酸残基开始，以C末端氨基酸残基为终点。*多肽链：是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端C末端牛核糖核酸酶上述五肽可简写表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln肽链的表示法(简写)（二）几种生物活性肽

1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH是细胞内重要还原剂，它保护蛋白质分子中的SH基团免遭氧化，使蛋白质或酶处于活性状态。GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+

GSH上的氢，在谷胱甘肽过氧化物酶的催化下，能还原细胞内产生的H2O2，使其变成H2O，同时GSH成为氧化型即GSSG，后者又在谷胱甘肽还原酶催化下，再生成GSH。因此，GSH是细胞内十分重要的还原剂。种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要见于垂体及下丘脑分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、

-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。2.多肽类激素及神经肽垂体后叶分泌的激素如催产素和加压素由下丘脑分泌的激素之一

促甲状腺素释放激素神经肽

甲硫氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Met

亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu

临床应用：镇痛例如脑啡肽：

Responsibleforsignaltransduction(信号转导)inneurotransmission

脑啡肽；内啡肽；强啡肽；神经肽Y三、蛋白质的分类*根据蛋白质组成成分

单纯蛋白质结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分*根据蛋白质形状

纤维状蛋白质球状蛋白质*根据蛋白质功能

蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein第二节蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)空间结构一级结构二级结构三级结构四级结构定义：指多肽链中氨基酸的排列顺序。一、蛋白质的一级结构主要的化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间结构和特定生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构主要的化学键：氢键

定义:指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链骨架原子的相对空间位置，不包括氨基酸残基侧链的构象。蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)

无规卷曲(randomcoil)

（一）

-螺旋

1.多肽链主链围绕中心轴呈有规律地螺旋式上升，顺时钟走向，即右手螺旋。2.每隔3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距为0.54nm。3.α-螺旋的每个肽键的Ｎ-Ｈ和第四个肽键的羰基氧形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平形。

-螺旋结构的要点如下：

左手和右手螺旋（二）

-折叠

多肽链主链走向呈折纸状，而氨基酸侧链Ｒ基团交替地位于折纸状结构上下方。在两条相邻的肽链之间形成氢键。

β-转角是指蛋白质分子的多肽链经常出现180º的回折，在回折角上的结构就称β-转角。通常由４个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N—H之间形成氢键。（三）

-转角和无规卷曲无规卷曲是指没有确定规律性的局部肽链结构。

三、蛋白质的三级结构疏水键（最主要）、离子键、氢键和范德华力等。主要的化学键:定义:整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即多肽链的整体构象。

1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x-射线衍射分析，测得了它的空间结构。

肌红蛋白(Mb)Mb是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段

-螺旋结构。整条多肽链折叠成紧密球形分子，氨基酸侧链上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面。Mb分子内部有一个袋形空穴，血红素居与其中。血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。核酸酶

视紫红质四、蛋白质的四级结构对蛋白质分子的二、三级结构而言，只涉及一条多肽链卷曲而成的蛋白质。而有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，其中每一个具有独立三级结构的多肽链称为蛋白质的亚基。蛋白质分子中各亚基之间的相对空间位置，称为蛋白质的四级结构。由一条肽链形成的蛋白质没有四级结构。主要的化学键主要是疏水键、氢键和离子键。血红蛋白的四级结构

血红蛋白：具有４个亚基组成的四级结构，可结合４分子氧。成人由两条α-肽链和两条β-肽链组成。

一级结构二级结构三级结构四级结构Mathewsetal(2000)Biochemistry(3e)p.195蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节（一）一级结构是空间结构和特定生物学功能的基础。一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。一、蛋白质一级结构与功能的关系

牛核糖核酸酶的一级结构二硫键天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性（二）一级结构与功能的关系例：镰刀状红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbS

β肽链HbA

β肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)正常人血红蛋白β链的第6位氨基酸是Glu，而镰刀状细胞贫血病人的血红蛋白中，Glu变成了Val，仅此一个氨基酸之差，本是水溶性的血红蛋白，就聚集成不溶性的纤维束，并引起红细胞变形成镰刀状而极易破裂，产生贫血。这种由蛋白质分子一级结构发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。ObservedNormalrangeRedcellcount2.6×106/ml4.6～6.2×106/mlHemoglobincontent8g/100ml14～18g/100mlWhitecellcount15,250/ml4,000～10,000/mlHbAβ-链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…HbSβ-链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…HbA（

adulthemoglobin）HbS（sickle-cellhemoglobin）

（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构

二、蛋白质空间结构与功能的关系

HemoglobinMyoglobin

肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质，它们是蛋白质结构与功能的范例。肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上具有明显的同源性，它们的构象和功能也十分相似。肌红蛋白Mb是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段

-螺旋结构。易与氧气结合，氧解离曲线呈直角双曲线。整条多肽链折叠成紧密球形分子，氨基酸侧链上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面。Mb分子内部有一个袋形空穴，血红素居与其中。血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。血红蛋白血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水袋形空穴，可结合一个血红素并携带1分子氧，因此1分子Hb共结合4分子氧。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb各亚基之间通过8对盐健，紧密结合成亲水的球状蛋白。成人红细胞中Hb主要是由两条α肽链和两条β肽链组成（α2β2）。

血红蛋白在氧分压较低时，与氧气结合较难，氧解离曲线呈Ｓ状曲线。但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后，即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，从而使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线Mb易与O2结合，而Hb在O2分压较低时较难结合O2

。Mb氧解离曲线为S状曲线，而Hb的为双曲线。因为：Mb第一个亚基与氧气结合以后，促进第二及第三个亚基与氧气的结合，当前三个亚基与氧气结合后，又大大促进第四个亚基与氧气结合。即Mb各亚基间存在正协同效应。血红蛋白中血红素辅基的结构O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态→R态）T态（tensestate）紧张态 R态（relaxedstate）松驰态。*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应

如果是抑制作用则称为负协同效应

变构效应(allostericeffect)蛋白质因与小分子物质相互作用而发生空间结构的改变，导致蛋白质功能的变化，称为变构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病

蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。这类疾病包括：疯牛病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一种人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第四节蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein（一）蛋白质的两性电离

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。一、理化性质

由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质（主要是指球状蛋白质）有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化膜”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。（二）蛋白质的胶体性质

*维持蛋白质亲水胶体稳定的因素：水化膜颗粒表面电荷+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固

*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂、超声波、紫外线、震荡等。变性的本质主要为二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构的改变。变性后，其溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)

。天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，溶解度降低，甚至肽链相互聚集，而从溶液中析出的现象。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。盐析法：加入大量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠），脱去水化层而沉淀。有机溶剂沉淀法：加入极性的有机溶剂如乙醇、丙酮等，破坏水化层而沉淀。重金属盐沉淀法：当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。生物碱或酸类沉淀法：当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀。加热变性沉淀法：蛋白质因加热变性而凝固。蛋白质沉淀法（四）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（五）蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应

蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。二、蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离纯化方法分子大小透析和超过滤密度梯度离心凝胶过滤溶解度等电点沉淀和pH控制盐溶和盐析有机溶剂分级分离法温度沉淀电荷离子交换层析等电聚焦层析聚焦电泳区带电泳聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）毛细管电泳蛋白质分离纯化方法吸附：吸附层析特异亲和力：亲和层析其它：如高效液相层析（HPLC）（一）透析及超滤法*透析

利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜）

，达到浓缩蛋白质溶液的目的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀

*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。*

免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。（三）蛋白质电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。