响应面法优化南瓜蛋白酶水解法制备胶原多肽工艺

响应面法优化南瓜蛋白酶水解法制备胶原多肽工艺

猪的体重是1%。猪的主要成分是水、蛋白质和脂肪，以及少量的纤维和矿物质。其中，水含量为70%75%，蛋白质为21%23%，脂肪约为1%，灰烬约为0.5%。猪皮中的蛋白质以胶原蛋白为主,约占80%以上,同时还含有少量白蛋白,球蛋白和弹性蛋白。据资料显示,我国猪的存栏数、出栏数、猪肉产量多年来均位居世界第一位,中国猪肉产量约占世界产量的一半之多,猪肉的产量占我国肉类总产量的69.4%。动物皮肤最重要的一个应用就是制革,但由于猪皮本身质地不佳,目前在皮革工业中已经很少采用猪皮,另外,由于猪皮有令人难以接受的特有的异味、不良的口感、消化率低、加工不方便等原因常将其扔弃,很少直接使用,造成了猪皮的大量积压,猪皮的营养价值和功用没有得到充分的发挥。因此,本实验选用木瓜蛋白酶水解猪皮制备胶原多肽,确定木瓜蛋白酶水解的最佳条件,为猪皮的开发利用找到一条新的出路。1材料和方法1.1材料和试剂新鲜猪皮为市售。木瓜蛋白酶(食品级)南宁东恒华道生物科技有限公司;其他试剂为国产分析纯试剂。1.2华峰仪器与增力电机阻压器JA5003电子天平上海天平仪器厂;SHJ-A恒温振荡水浴锅金坛市华峰仪器有限公司;Delta320酸度计梅特勒-托利多仪器(上海)公司;JJ-1增力电动搅拌器金坛市恒丰仪器厂;TD5A-WS台式低速离心机赛特湘仪离心机仪器有限公司。1.3方法1.3.1酶水解反应法1.3.1.加热加热,保持6min将新鲜猪皮清洗去除污物后,将表面的油脂刮除,放入锅内、加适量的水,加热至100℃后保持5min。取出煮熟的猪皮,稍凉后再用刀将表面的脂肪刮去,拔掉猪毛,然后将皮块切成10mm×10mm左右大小的皮块。1.3.1.2.下降采用皂化法脱脂,脱脂剂为3%的Na2CO3,脱脂温度为40℃,脱脂时间为40min,冰箱冷冻保存待用。1.3.1.灭活酶离心弃去沉淀经过前处理的猪皮→加入一定量的去离子水→调pH值→加入一定量的蛋白酶→恒定温度、水解一定的时间→沸水浴10min灭活酶→离心弃去沉淀1.3.2耗碱量的测定采用甲醛滴定法。具体测定方法为:将水解液在4000r/min下离心10min取5ml上层清液,用0.1mol/L的NaOH溶液滴定到pH8.2,加入5ml37%的甲醛溶液(所用甲醛溶液先用NaOH滴定到pH8.2),再用的0.1mol/L的NaOH滴定到pH8.2。记录加入甲醛后把溶液滴定到pH8.2所耗碱量。pH值测定使用精密pH计。然后计算蛋白质的水解度:猪皮胶原蛋白彻底水解的方法是将猪皮在6mol/L的HCl中于105~110℃下水解24h。2结果与分析2.1单一解水条件分析2.1.1结果图1根据相关资料初步确定其反应条件为:反应温度60℃,酶浓度0.6%(酶量以猪皮重量的百分数计),底物浓度25%(固液比),反应时间4h。选择了5个pH值进行单因素分析,结果如图1所示。由图1可见,pH值对水解度有一定的影响。当pH值从3.0增加到6.0时,水解度有所上升;当pH值从6.0增加到9.0时,水解度有所降低。而pH值在4.0~6.0范围内水解度较为稳定,且在一个较高的水平上。每一种酶都有其适合的pH值作用范围,在这个作用范围内酶的催化活性部位含有的可解离的基团得到了最充分的解离,使酶的活性中心与蛋白质底物充分结合,从而将底物最大程度地转化为水解产物,使水解度达到最大值。pH值偏高偏低都会导致水解度的下降。因此,确定pH值范围为4.0~6.0。2.1.2单因素分析试验根据相关资料初步确定其反应条件为:反应pH5,酶浓度0.6%(酶量以猪皮重量的百分数计),底物浓度25%(液固比),反应时间4h。选择了6个温度值进行单因素分析,结果如图2所示。由图2可知,当温度从30℃增加到60℃,水解度逐渐升高;而当温度从60℃增加到80℃,水解度逐渐下降。其原因是,当酶解温度在30~60℃范围内时,随着温度的上升,木瓜蛋白酶逐渐被激活,因而水解度不断上升。但当温度大于50℃时,由于温度过高,引起木瓜蛋白酶受热变性,逐渐失活,所以水解度逐渐下降。因此,温度取值范围为50~70℃。2.1.3图1为不同的对象,我国专家对目前存在的问题a根据相关资料初步确定其反应条件为:反应pH5,反应温度60℃,底物浓度25%(液固比),反应时间4h。选择了7个酶浓度值进行单因素分析,结果如图3所示。由图3可知,当酶量从0.2%增加到0.8%,水解度以较快的速度升高;当酶量从0.8%增加到2.0%的过程中,水解度上升的速度已十分缓慢。这是由于水解底物是有限的,当酶量达到一定程度时,就可将大部分的底物反应掉。由于水解底物的缺乏,这时即使再增加酶量,也无法使水解度得到显著的提高。因此当酶量达到0.8%以后,水解度曲线就趋于平坦。考虑到成本问题,选酶浓度的范围为0.8%~1.0%。2.1.4单因素分析结果根据相关资料初步确定其反应条件为:反应pH5,反应温度60℃,酶浓度0.6%(酶量以猪皮重量的百分数计),反应时间4h。选择了8个底物浓度值进行单因素分析,结果如图4所示。由图4可知,底物浓度过低或过高都会降低水解度。底物浓度过低,会降低反应体系中的酶浓度,使水解度下降。底物浓度过高,体系有效水浓度过低,降低了底物蛋白分子和酶分子的扩散和运动,从而降低了底物与酶分子的碰撞几率,使反应速度降低;另一方面,体系中高浓度的底物蛋白可能集聚于蛋白酶的活性部位,形成无活性的中间产物,抑制水解反应。同时,加水量的增加也给后续工序,如浓缩增加负荷。故选择底物浓度的最适范围为30%~40%。2.1.5反应时间h根据相关资料初步确定其反应条件为:反应pH5,反应温度45℃,酶浓度0.6%(酶量以猪皮重量的百分数计),底物浓度25%(液固比),反应时间4h。选择了7个时间值进行单因素分析,结果如图5所示。由图5可知,反应时间超过2h之后,水解度的增加就不太明显了。另外考虑到水解时间过长,不利于工业生产,我们确定木瓜蛋白酶水解猪皮的最适时间为3h,并固定此条件,在下一步的正交试验中不再对该因素进行筛选。2.1.6最佳酶解条件的确定分析可知,影响木瓜蛋白酶酶解的主要因素有pH值、温度、酶用量、底物浓度。通过单因素试验,找出这些主要影响因素的水平,采用L9(34)正交试验,水解3h,以水解度为评价指标,确定最佳酶解条件。因素水平表见表1,正交试验结果见表2,各因素与水解度关系的直观效果图见图6。由表2可知,极差的大小顺序为B>C>A>D,因此,影响因素主次顺序也为B>C>A>D,即B因素的影响极大,C因素次之,而后是A因素,D因素的影响最小。根据正交试验的结果,初步确定木瓜蛋白酶水解猪皮制备胶原多肽的最佳组合条件为A2B2C2D1,即最适pH为5,最适温度为60℃,最适酶量为0.9%,最适底物浓度为30%。在最佳条件下,通过验证实验确定最优组合的水解度为14.91%。3胶原多肽的制备目前在国外对于猪皮已有一些利用,如德国的赫斯特公司己发明了一种猪皮软化剂,经软化处理的猪皮质地柔软,很容易进行加工处理成多种猪皮食品。又如德国的汉诺威袋装香肠中猪皮的添加量竟高达36%。利用猪皮制备胶原多肽的研究成为近年的热点问题。猪皮中提取胶原多肽的方法主要有:酸法、碱法、酶法。酸碱法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质。但由于碱法水解使氨基酸大多消旋,无生物利用价值,因此不宜采用;而酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应,反应强烈,设备腐蚀严重,水解彻底,多生成氨基酸混合物,同时在高温下色氨酸完全被破坏,目前已渐被淘汰。酶法水解蛋白的研究,最初是始于利用酶部分降解蛋白质,增加其分