不同脉场条件下溶菌酶抑菌能力的变化

不同脉场条件下溶菌酶抑菌能力的变化

1922年，细菌学家flam首次发现了溶解酶，也被称为dase。它是由18种129个氨基酸组成的多肽,分子量为14.6kD,广泛分布于生物体内,具有生物相容性好,对组织无刺激、无毒性等优点。临床证明溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力等生理功能,是婴儿生长发育必须的抗菌蛋白。特别对早产婴儿,有防体重减轻,预防消化器官疾病,增进体重等功效。所以溶菌酶是婴儿食品、婴儿配方奶粉、饮料等良好的添加剂。溶菌酶广泛分布于生物体内,在母乳、牛初乳和蛋清液中含量丰富,其中蛋清液是获取天然溶菌酶的最好来源。高压脉冲电场(PulsedElectricFields,PEF)是一种非热处理技术,在蛋乳等流体食品的杀菌保鲜方面的研究已有很多报道,但对蛋乳制品中的溶菌酶的活性影响未见报道。作者利用PEF技术对鸡蛋蛋清液中提取的溶菌酶对大肠杆菌的抑菌活性进行了研究,为PEF技术的广泛应用提供技术参考。1材料和方法1.1水、电、纳、苯磺酸钠phs及高压脉冲电场pef装置溶菌酶购自大连绿雪蛋品发展有限公司,酶活力>20000u/mg;大肠杆菌(E.coli-K12)取自吉林大学畜牧兽医学院;其他试剂均为分析纯;水为超纯无菌水。pHS-2型精密酸度计购自上海雷磁仪器厂;752型可见紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司;970型荧光分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司。高压脉冲电场(PEF)装置:三角波形如图1所示,脉冲宽度2μs,脉冲电场强度1~40kV/cm,脉冲频率1~3000Hz;示波器(HEWLETTPACKARD54600B.USA)显示电极两端电压;蠕动泵供料(D100A,CHINA)。1.2实验方法1.2.1菌体浓度测定活化菌种:无菌操作下将斜面保藏的大肠杆菌接种于己制好灭菌的营养琼脂斜面上,接种数支,并于37℃培养24h,连续接种两代。菌悬液培养:将大肠杆菌(E.coli)接种于营养琼脂培养基(PYG)中,37℃下摇瓶培养10h,菌液浓度达到1011cfu/mL。细菌记数:(采用平板菌落记数法记数细菌),计算出原菌悬液的菌体浓度(cfu),在此基础上稀释合适的倍数,测定各浓度对应的吸光度值。绘制标准曲线:将上述得到的不同稀释度的菌落数与相应的吸光度值作出菌落数为横坐标、吸光度值为纵坐标的cfu-OD560曲线。1.2.2pef处理取8mL无菌的PYG培养基试管,加入1011cfu/mL的E.coli菌悬液1mL摇匀。再分别加入1mL经过PEF处理的浓度为0.1%溶菌酶溶液,不同PEF电场条件处理的溶菌酶溶液平行做三次。将试管置于恒温培养箱中37℃培养9h,然后在560nm处测定OD560值。将不经PEF处理的浓度为0.1%溶菌酶溶液1mL加入上述培养基中进行37℃培养9h,作空白样进行对照分析。1.2.3酶系统的脉冲场在室温条件下,取浓度为0.1%的溶菌酶溶液,立即经不同的脉冲电场强度和不同脉冲数处理。电场强度选择在40kV/cm以下。脉冲数设定在20个以内。1.2.4荧光光谱分析蛋白质是由氨基酸组成的,其天然荧光是由于芳香族氨基酸——酪氨酸和色氨酸的存在。通过测定荧光强度可以研究酶蛋白的三级结构是否发生变化。用荧光分光光度计来测定溶菌酶的荧光光谱。溶菌酶液用超纯水稀释10倍。相对荧光强度=[PEF处理后酶液的荧光强度/未经任何处理酶液的荧光强度]×100%2结果2.1各性方程的线性方程由图2可知,细菌浓度与吸光度值呈线性关系,线性方程为:y=0.0013x+0.01,相关性R2=0.9751。用于不同吸光度的菌悬液的细菌活菌浓度的计算,以此判断抑菌效果。2.2pef对溶菌酶抑菌能力的影响图3为PEF处理脉冲电场强度对溶菌酶活性的影响曲线。在PEF处理后立刻测定,发现随脉冲电场强度(脉冲数均设定为4个)的增强,溶菌酶抑菌能力呈波浪式变化,在10kV/cm时,抑菌能力增加不显著;在25kV/cm时,OD560值为0.252,抑菌能力达到最大值;其对照样OD560值为0.282,比对照样提高10.6%,之后随着电场强度的增加抑菌能力下降。在PEF处理后溶菌酶液放置于4℃下贮藏,贮藏1h和10h后,重新测定溶菌酶抑菌效果。发现酶活都有一些增加,且随着电场强度的增加,溶菌酶抑菌能力的变化规律和处理后直接测得的结果相似,在25kV/cm时,抑菌能力达到最大值,且结果变化显著。在PEF处理后10h时,酶的抑菌能力和1h时对应电场强度测得的结果比较,溶菌酶的抑菌能力又有下降趋势。2.3时间对溶菌酶抑菌能力的影响除脉冲强度以外,脉冲数对溶菌酶抑菌能力也有影响。图4为在电场强度为25kV/cm时,不同脉冲数对溶菌酶抑菌能力的影响情况。可以看出,随着脉冲数的增加溶菌酶抑菌能力也发生变化,但在设定的脉冲数内抑菌能力变化不显著。在PEF处理后溶菌酶液放置于4℃下贮藏,贮藏1h和10h后,重新测定溶菌酶抑菌效果。随着脉冲数的增加,溶菌酶抑菌能力的变化规律和处理后直接测得的结果基本一致。2.4酶液中荧光强度的变化通过荧光光谱扫描,PEF处理前溶菌酶的最大激发波长λex和最大发射波长λem分别为286nm和361nm,主要表现为色氨酸残基的荧光特征。在两个波长都确定的情况下测定溶菌酶的荧光强度。图5表明,脉冲电场处理后的溶菌酶荧光强度都有所增加,在25kV/cm的电场强度时相对荧光强度最大,与对照组相比提高了15.42%。将电场处理过的酶液在4℃贮藏1h和10h后,再分别测定溶菌酶的荧光强度,贮藏1h和10h后的荧光强度的变化规律基本与处理后直接测定的结果变化规律相同,但10h后的荧光强度与直接测定和贮藏1h后相比,相对荧光强度变化较小。图6是不同脉冲数对溶菌酶荧光强度的影响。与未接受脉冲的对照样相比,当脉冲强度一定时(25kV/cm),随着样品接受脉冲数的增加,相对荧光强度在6个脉冲数时最大,在6个脉冲数以内贮藏1h相对荧光强度相应地有所增加,在6个脉冲数以上贮藏1h相对荧光强度相应地有所减少,但变化均不显著。而贮藏10h测得的相对荧光强度与贮藏1h相比有所下降,但变化也不显著。3溶菌酶分子中色氨酸残基的变化对溶菌酶而言,其抑菌能力与脉冲强度表现出波的轮廓。这种变化可能是由于更多活性点的产生或由于活性点的尺寸的增加,因此反应速度增加。此外,高脉冲电场也可能导致由于邻近效应和定向效应而增加酶反应的激活自由能,从而使反应的速度加快。随着放置时间的延长,溶菌酶分子之间通过疏水相互作用、二硫键、静电相互作用及氢键等重新形成分子聚集体,酶蛋白表面积缩小,活性点减少,因此抑菌活性下降。一般认为,溶菌酶分子中有6个色氨酸残基,其中4个在酶分子表层部位,2个包埋在酶分子的内部。溶菌酶分子中有4个双硫键,因而是一类结构比较稳定的蛋白质。溶液中溶菌酶的荧光强度的变化能够较直观地显示PEF处理后介质中色氨酸残基微环境的变化,PEF处理后溶菌酶构象的改变导致酶的抑菌能力发生了变化,但是两者之间是否存在对应的构效关系,有待进一步研究。4贮藏期间溶菌酶的抑菌能力(1)随着脉冲强度的增加,溶菌酶抑菌能力呈波浪式变化,在25kV/cm时,抑菌能力达到最大值,比对照样提高10.6%。PEF处理后溶菌酶液放置于4℃下贮藏1h和10h后,溶菌酶抑菌能力都有一些增加,变化规律和处理后直接测得的结果相似,而随着贮藏时间