生物组学方法在酒酒球菌生物调节和代谢中的应用

生物组学方法在酒酒球菌生物调节和代谢中的应用

20世纪的生物学经历了从宏观到微观的发展过程，从形式和表现的角度逐渐分解，细分到各种生物体及其功能的研究。在2003年完成的人和多种模式生物体基因组图谱以及随后发展的各种组学技术把生物学带入了系统生物学时代。系统生物学是在细胞和生物体整体水平上研究其所含有的结构、功能各异的生物分子及其这些生物分子间的相互作用,并通过生物信息学的手段来定量描述和预测被研究对象的生物功能、表型和行为的一门学科。系统生物学的主要技术平台是由基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学所构成。这些组学分别在DNA、mRNA、蛋白质和代谢物水平上检测和鉴别各种分子并研究其功能。图1显示了系统生物学中的各生物组学间的关系以及它们的研究框架。酒酒球菌(Oenococcusoeni)是触发葡萄酒苹果酸-乳酸发酵(malolacticfermentation,MLF)的主要微生物,其可通过MLF过程降低葡萄酒自身的酸度,并提高葡萄酒的质量和稳定性。由于酒酒球菌在葡萄酒酿造工业中的重要地位,在生物组学不断发展的后基因时代,越来越多的研究者希望通过各种生物组学平台以及它们的联合来更进一步的探究酒酒球菌所处环境对其胞内和胞外代谢体系的响应以及细胞自身的调控机制,使其更好的发挥一个模式生物的价值,进一步促进其在葡萄酒酿制工业上的应用。本文将对基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和生物信息学的相关研究技术平台和其在酒酒球菌研究中的应用进行综述。1rodack的提出基因组学(genomics)的概念由美国科学家ThomasRoderick于1986年首次提出。作为遗传学的一个分支,基因组学是研究生物基因组和如何利用基因的一门学科。其主要研究内容包括基因序列测序、基因组图谱绘制和基因组结构、功能分析三方面。1.1encegechi1.在分析实验中的应用基因组学研究平台主要由两方面技术组成,其包括测序技术和基因组比对技术。当今,生物体基因组的测序工作主要运用的是“鸟枪”测序法(shotgunsequencingmethod)。在基因组比对分析实验中,多采用比较基因组杂交技术(array-basedcomparativegenomehybridization,aCGH)分析技术。aCGH分析是比基因组杂交比对(comparativegenomichybridization,CGH)水平更高的检测基因组复制数量变化的技术。这项技术能够快速的检测细菌基因组的可塑性和未知基因组的相关信息。aCGH分析技术技术被认为是全基因测序分析的替代技术。1.2酒酒球形基因组测序和分析O.oeniPSU-1是在1972年由宾夕法尼亚大学从自然启动酒苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒中分离得到的,现在这一菌株已成功完成了其在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵中的商业应用。在2002年,乳酸菌基因联盟(LacticAcidBacteriaGenomeConsortium)与美国能源部联合基因组研究所(JointGenomeInstitute,USDepartmentofEnergy)合作,完成了酒酒球菌O.oeniPSU-1基因组测序和基因图谱绘制的工作。在2006年,AlineLonvaud-Funel实验小组完成了对从法国波尔多红葡萄酒中分离得到的酒酒球菌ATCCBAA-1163(文章未发表)的基因组序列的测序工作。在2010年,由澳大利亚的Borneman研究小组分离得到的酒酒球菌O.oeniAWRIB429也成功完成了基因组序列的测序工作。2012年,同样是澳大利亚的Borneman小组,其又分别对来自商业发酵和自然环境的11株酒酒球菌的基因组序列进行了测序。在对酒酒球菌基因组序列测序的过程中,所有的研究小组都运用的是“鸟枪”测序法来完成测序工作的。在测序工作完成的同时,不同酒酒球菌菌株间的比对工作也相应陆续的展开。在2010年,Borneman等使用基因组矩阵杂交对比分析法,以酒酒球菌PSU-1为模式菌株,研究了10株葡萄酒酒酒球菌基因组的多样性。基于aCGH芯片的分析发现,在PSU-1基因组中存在的基因在AWRIB429基因组中大量缺失,这一结果显示了酒酒球菌基因组中不同区域的高度多样性。基因组测序和aCGH分析技术的综合应用能够很好的展示酒酒球菌菌株间基因组的差异。在对酒酒球菌ATCCBAA-1163(AAUV00000000)、AWRIB429(ACSE00000000)和PSU-1(CP000411)基因组的对比中发现,前两个菌株显示出与菌株PSU-1所截然不同的单核苷酸链遗传多态性。另外,在菌株AWRIB429的基因组中大约拥有400个开放式读码框(openframe),而PSU-1的基因组却没有。2012年,同样是Borneman的实验小组又利用11株酒酒球菌的基因组序列进行了比对分析。研究发现,其所测序的所有菌株都包含1800个编码蛋白质的基因。再对这些菌株的基因组共线性和蛋白质同源性的深入比对后发现其有超过2800个同源开放式阅读框共同组成了它们的基因组,其中至少有1200个基因被确认为是这11株菌的较为保守的看家基因。另外,研究也同样说明,对拥有蛋白质编码能力的酒酒球菌基因组相关数据的不断扩充主要是由酒酒球菌基因组中拥有的多重独立的噬菌体序列的位点多样性和对菌株商业性能具有潜在影响的多种代谢功能所导致的;这些代谢功能包括细胞壁表多糖的生物合成,糖类物质的运输和利用,以及氨基酸的生物合成。2基因表达规律基因组测序和基因组对比的研究对象为DNA,而转录组学的主要目的是分析基因的表达和在特定环境下基因表达的规律。转录组即在一个活细胞中所能转录出的全部RNA分子的总和,这其中包括mRNA、rRNA、tRNA,以及一些非编码RNA。而转录组学(transcriptomics)是一门在整体水平上研究细胞中基因转录表达情况及转录调控规律的学科。2.1t-qpcr技术实时荧光定量PCR(realtime-qPCR,RT-qPCR)技术是研究基因转录组学的重要手段,这一技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,目前已在酒酒球菌转录组学的研究中得到了广泛应用。2.2不同ph值的酸发酵基因对酒酒菌种抗氧化酶系统的影响大量有关酒酒球菌生理代谢相关基因表达的研究已完成。2007年,通过运用RT-qPCR技术,Augagneur等研究了L-苹果酸和柠檬酸对酒酒球菌有机酸代谢基因maeP、yaeP和mleP的影响。这些基因的RT-qPCR分析是在不同的pH值条件下进行的,其中包括模拟葡萄酒中的低pH值环境。表达分析结果显示,L-苹果酸可以提高mleP基因的表达量,高pH值和柠檬酸的存在可以提高yaeP基因的表达水平,而maeP基因的表达不受pH值变化或柠檬酸是否存在的影响。2009年,Olguín等通过使用RT-qPCR技术研究了酒酒球菌柠檬酸代谢机制相关基因在乙醇胁迫和酸胁迫条件下的表达。结果显示,在乙醇存在的条件下,maeP、citI和citE基因会过量表达,而pH值的变化对这些基因的表达量没有任何影响。但是,alsD基因的表达量会随着苹果酸-乳酸发酵的进行而增加。同时,在所研究的基因中,citE、ackA和alsD拥有独立的转录体系。最后,通过对这些基因的表达情况分析后发现酒酒球菌细胞中的柠檬酸代谢途径是其抗逆应答体系中的一个重要组成部分。另外,在2011年,Costantini等通过利用RT-qPCR技术对一株商业酒酒球菌菌株O.oeniMLD的mleP基因和两个与ATP结合盒转运子相关的基因(oeoe_1651和oeoe_0550)在复水条件下的表达进行了研究。实验发现mleP基因和oeoe_1651基因在菌体复水几分钟后会立即进行大量的转录表达。这一研究为提高商业酒酒球菌冻干粉的复水活性奠定了基础。其他的一些研究用来阐述酒酒球菌在葡萄酒发酵逆境下的抗逆应答机制。当酒酒球菌接种于葡萄酒中时,酒酒球菌就被暴露在低pH值,高酒精体积分数和营养缺乏等逆境条件下。为了能够在这样的极端条件下生存,酒酒球菌进化出了自己的一套抗逆机制。其中通过合成不同的抗逆蛋白,例如热休克蛋白、分子伴侣和ATP依赖性的蛋白酶,是酒酒球菌胁迫适应机制中的一种。有大量抗逆蛋白基因表达相关研究被报道。在前期研究中,Coucheney等发现hsp18基因所编码的小热休克蛋白Lo18与酒酒球菌的生长和苹果酸-乳酸发酵能力之间的协作关系。实验证明,当菌体处在pH值为3.0的环境下时,酒酒球菌体内的hsp18基因会过量表达,而其所合成的大量小热休克蛋白Lo18会显著提高酒酒球菌的存活率和苹果酸-乳酸发酵能力。其他研究人员利用RT-qPCR技术对酒酒球菌hsp18基因表达量的研究同样证实了这一协作关系。Capozzi等在其研究中发现当酒酒球菌中的多个不同抗逆基因的表达水品达到最高时,酒酒球菌的苹果酸-乳酸发酵会处于最佳状态。而hsp18基因能够在酒酒球菌中大量表达的这一性质使得这一基因可以作为酒酒球菌直投存活率和苹果酸-乳酸发酵能力的评价标准。除了hsp18基因之外,例如groES、grpE、ctsR、clpL、clpP、clpX和trxA等大量其他类型的抗逆蛋白基因相继被研究,并且部分基因的表达体系已得到定量分析。而研究人员对于这些抗逆基因转录表达的研究为揭示酒酒球菌的相关抗逆机制提供了宝贵的数据信息。3蛋白质组学蛋白质组的概念由澳大利亚macquario大学的wilkin和smith于1994年提出。它是细胞中所有物质的全部蛋白质。1997年，蛋白质组的概念与基因组学一起提出。这是生物细胞乃至完整生物体表达的所有蛋白质及其结构和功能的一个学科3.1般的组学研究方法:2d-东南角法高效率的分析方法是蛋白质组学研究的基础,在这其中蛋白质双向电泳技术(two-dimensionalgelelectrophoresis,2D)是蛋白质组学研究中使用较为普遍的一种方法,其分离原理是依据蛋白质的等电点和分子质量之间的差异来进行分离。3.2苹果酸-乳酸发酵酒酒球形发酵中总蛋白的表达通过使用2D技术,Silveira等对乙醇胁迫下OenococcusoeniGM的细胞质和细胞膜中特定位点上的蛋白类物质进行了研究。蛋白质组分析结果显示乙醇胁迫激发了酒酒球菌细胞中蛋白类物质结构的变化,在分离得到的28个蛋白中有50%参与了细胞的代谢功能进程。研究发现当液体培养基中的乙醇体积分数由原来的8%升高至12%,并保持1h后,细胞中的肌苷单磷酸脱氢酶和磷酸葡糖脱氢酶的含量会减少,而谷胱甘肽还原酶的含量会升高,这表明保持酒酒球菌细胞中的氧化还原平衡对其适应生存环境中的乙醇胁迫有着重要的意义。与此同时,实验还发现在酒酒球菌细胞处于乙醇胁迫时,其细胞中的甘露糖磷酸转移酶系统(mannosephosphotransferasesystem,PTS)中的磷光载体蛋白HPr和EIIMan也会随之缺失,这证明在进行苹果酸-乳酸发酵时酒酒球菌细胞中的甘露糖磷酸转移酶系统是处于停滞状态的。另外,实验还证明酒酒球菌细胞中的葡萄糖脱氢酶和丙氨酸连接酶参与了其细胞壁的合成。这些发现为在细胞水平和膜蛋白水平上研究酒酒球菌抗乙醇胁迫应答提供了依据。除了乙醇胁迫之外,Zapparoli等评估了酒酒球菌在生长稳定期时细胞抗贫营养胁迫的相关蛋白。运用2D技术研究在细胞培养的不同阶段酒酒球菌中总蛋白的表达体系,通过酒酒球菌细胞中总蛋白的变化来研究在贫营养条件下酒酒球菌的抗逆机制。研究小组对在FT80培养基(pH5.3)中生长了3d和10d的酒酒球菌细胞中的总蛋白运用进行了分析。研究发现,与生长3d的酒酒球菌相比,生长10d后的细胞中的186种蛋白中有81种的含量发生了改变,其中有15种蛋白的含量在显著增加,43种蛋白的含量在显著减少。研究还显示,在生长3d的菌体中有13种蛋白是其所特有的,而有10种蛋白是生长10d后的细胞中所特有的。这些发现为研究人员了解酒酒球菌在贫营养条件下的抗逆机制提供了依据。最近,Cecconi等通过蛋白质组的差异性比较来研究酒酒球菌LalvinVP41的冻干粉在苹果酸-乳酸发酵前的适应性培养中细胞的应答机制,从而证明苹果酸-乳酸发酵前适应性培养对提高酒酒球菌LalvinVP41冻干粉对极端环境适应性的重要意义。结果显示,在对比了经过适应性培养和没有经过适应性培养的菌株的在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中蛋白质组之后,发现前者能够更好的适应酒中的极端环境。另外,Folio等从酒酒球菌ATCCBAA-1163中分离得到了一种新的具有蛋白酶活性的胞外蛋白,其被命名为EprA。之后,Folio研究小组利用蛋白质组学技术分析了ATCCBAA-1163在两种含氮量不同的培养基中生长。结果显示在两种不同的含氮环境中,这一蛋白拥有相同的性质。4jearmichiolson博士,以日本培养的jearmi在生产技术与基因组学、转录组学和蛋白质组学相比,代谢组学是一门阐述生物完整代谢体系的新兴生物组学学科。其由英国伦敦帝国理工大学的JeremyNicholson教授创立。主要的目的就是了解在特定环境下参与生物体细胞各种代谢途径中所涉及到的所有生化分子的种类和性质,这些生物分子包括各种肽段、氨基酸、核酸、糖类物质、有机酸、多酚类物质、脂类物质和能被微生物细胞利用或合成的所有化学组分。4.1massspicarege结构法当前,为细胞代谢产物进行定性和定量的技术平台有很多,其中包括核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)、气相色谱-质谱法(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)、毛细管电泳-质谱法(capillaryelectrophoresis-massspectrometry,CE-MS)、液相色谱-质谱法(liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS)、高效液相色谱法(high-pressureliquidchromatography,HPLC)、直喷式质谱(direct-injectionmassspectrometry,DIMS)和傅里叶红外光谱(Fouriertransforminfrared,FT-IR)。4.2不同菌株的发酵特性直到最近,代谢组学才被大量的应用于医药研制和的食品营养检测。然而代谢组学在葡萄酒发酵工业中却鲜有应用。葡萄酒中含有大量的化学物质,而这些物质中的大多数都为酿酒微生物在发酵过程中产生的二次代谢终产物。2009年,Boido等的研究了酒酒球菌DSM7008和D-11对Tannat红葡萄酒中挥发性物质的影响。通过利用GC-MS技术研分析了不同挥发性物质在Tannat葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中的浓度变化。在实验中当两株酒酒球菌完成MLF之后,共有37种挥发性成分在Tannat葡萄酒中被检出和定量,其中包括醇、酯、酸和酚类化合物。通过方差分析发现MFL对Tannat葡萄酒中的17种挥发性组分有明显的影响,对8种挥发性组分有轻微的影响。例如,在D-11菌株完成MLF后,酒中的酯类物质,如异戊酯、异丁酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、γ-丁内酯、乙酸乙酯和泛内酯的含量都会随之升高,其中乙酸乙酯和泛内酯的含量增加最为显著,而乙酸己酯和的己酸乙酯的含量却会随之降低。而对于醇类物质,在D-11完成MLF后,其酒中的2-苯乙醇、甲硫基丙醇和正己醇的含量都会有所增加,其中以己醇的含量增加最为显著。另外,酒中挥发性酸丁酸和异丁酸的含量也都会显著增加。而当DSM7008菌株完成MLF时,酒中乙酸乙酯的含量会显著上升,而乙酸己酯和乙酸异丁酯的含量会减少。另外,挥发性酚类物质4-乙烯基愈创木酚和4-乙烯基苯酚的含量也都会有显著的增加。两株酒酒球菌都会通过自生生物代谢的特性了提高葡萄酒的香气复杂度,尤其是D-11菌株,其可明显提高酒中乙酸乙酯的含量,而乙酸乙酯能过赋予葡萄酒果香。另外,研究同样发现在进行完瓶中陈酿后,葡萄酒中的醋酸盐和酯类物质的浓度会有所下降,这一变化也会影响葡萄酒香气的变化。在另外一个研究中,Lee等运用代谢组学实验手段对5种商业酒酒球菌菌株酒酒球菌MCW、Enofermα、Wyeast、Vinibacti111和Vinibacti222的苹果酸-乳酸发酵特性进行了检测。实验通过NMR和GC-MS法进行分析。结果显示不同菌株的发酵行为对其次级代谢产物种类变化的影响要远强于对初级代谢产物种类变化的影响。另外,Lee等同样研究了不同菌株对葡萄酒的影响。实验利用NMR和GC-MS比较了葡萄酒中一株商业酒酒球菌与L.plantarum的发酵特性和代谢能力。结果显示,在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中L.plantarum产生初级代谢产物的能力远强于酒酒球菌。这一结果表明不同种类的乳酸菌产生初级代谢产物和次级代谢产物的能力有所不同。虽然人们在代谢组学研究中取得了长足的进展,但是各种技术的使用还是处在一个不成熟的阶段,并且大多数的研究都存在深度不足的问题。另外,代谢能力的计量准确还有待提高。对于葡萄酒中由低分子质量化合物的全面的动态化学分析尚不能通过一种单一有效的代谢组学研究技术来完成。然而,现在所拥有的代谢组学研究技术已能很好的完成微生物代谢组学的相关研究。5aulindnhig对生物系统的信息化处理生物信息学(bioinformatics)一词源自于19世纪70年代末PaulienHogeweg与BenHesper两位科学家对生物系统的信息化处理的相关研究。其是利用信息学的技术,其中包括从应用数学、计算机科学以及统计学等学科衍生出的各种方法,以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的一门学科。5.1代谢组学研究数据,可供研究人员免费登陆和获取研究所需的相关数据。在大量基因组数据的产生的同时,将这些数据转化为可视信息也变得至关重要。现有的基因组可视化工具包括GenomeAtlas、MicrobialGenomeViewer和GENEWIZ等软件。如同基因组学研究,在酒酒球菌代谢组学的研究中同样会产生大量的实验数据。这些数据在没有生物信息学数据库和相关软件的帮助下是无法进行分析和研究的,而这些数据库和软件都能够在互联网上获取得到。这些数据库主要提供的是生物化学物质的名录,以及它们的特性、