不同相对分子量的壳聚糖抑菌作用及机理研究

不同相对分子量的壳聚糖抑菌作用及机理研究

1979年，allan等人提出了壳聚糖的抗菌性，其抗菌性和抗菌机制一直是国内外科学家的研究热点，相关报告层出不穷。但对其抑菌机理尚无明确定论,而且对不同相对分子质量壳聚糖的抑菌效果的研究也不完全一致。目前关于壳聚糖抑菌作用规律的研究较少,作为系统研究之一,本文采用体外抑菌法分别测定了六种不同相对分子量的壳聚糖对五种常见菌的抑菌活性,对壳聚糖的抑菌机理做了探讨,以期为壳聚糖开发应用提供科学依据。1实验设备和材料1.1上海合作大学s2cjbu好氧生化技术中心LDZX40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅(上海中安医疗器械厂);生化培养箱(国华电器);SNCJ1BU无菌操作台(苏净集团安泰公司);DENSIMAT型细菌电比浊仪(法国生物梅里埃公司)。1.2实验材料1.2.1降解制备d相对分子量100万、80万(浙江玉环县壳聚糖有限公司,DD.98%);20万、14万、10万、5万(DD.95%,H2O2-HAc降解制备);脱乙酰度(DD.)87%、98%由分子量为50万(DD.65%)的壳聚糖按文献方法制得,DD.值测定采用酸碱滴定法。1.2.2供试菌种大肠杆菌(Escherichiacoli,ATCC35218),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC26113),变形杆菌(Proteusspecies,ATCC12453),白色念珠菌(Candidaalbicans,ATCC10231),绿脓杆菌(P.aeruginosa,ATCC27853)由天水市中医医院化验科提供。1.2.3牛肉浸膏ph的确定pH7.1;肉汤培养基(0.3gNaCl,1.0g蛋白胨,0.3g牛肉浸膏每100mL溶液),1mol/LNaOH调其pH=6.3。2实验方法2.1皮聚糖室外感染实验2.1.1细菌的激活受试菌种(标准菌株)接种于固体琼脂培养基,37℃活化24h,金黄色葡萄球菌活化48h。2.1.2悬浮液的制备将活化后的受试菌种用接种环挑取菌苔于生理盐水中,制成含菌数浊度约为0.5Mcf的菌悬液备用。2.1.3壳聚糖浓度对培养基的影响将直径为6mm的圆形滤纸片放入各不同分子量、不同浓度的壳聚糖溶液中一同高压蒸汽灭菌(120℃、0.12MPa)20min。取各菌悬液100μL均匀涂抹在培养基平皿表面,用无菌镊子将各滤纸片贴在各种含菌平皿上,每皿贴7个,分别对应于6种壳聚糖浓度及对照。实验壳聚糖浓度设置分别为2%、1.5%、1.0%、0.5%、0.25%、0.125%。培养皿中间贴1%的醋酸为对照,对照样除不加壳聚糖外,其他条件与加有壳聚糖的培养基一致。每种菌种重复3次试验,在37℃下培养24h,测定圆滤纸片的抑菌圈直径。2.2壳聚糖的最低抑制浓度测定取15mL融化的琼脂培养基,加入等量不同分子量的壳聚糖-1%HAc溶液,使每个试管壳聚糖含量分别为0.025%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%,灭菌,冷却后加入100μL约0.5Mcf的各被试菌菌悬液,涂布均匀后于37℃培养24h,观察菌落生长情况,以不长菌的壳聚糖最低浓度为壳聚糖对各供试菌的最低抑制浓度。2.3壳聚糖的测定接种前先用显微镜活菌计数法测定每毫升菌液中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的含菌个数,实验中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别为1.0×106个/mL、2.5×106个/mL。用移液枪各移取500μL至不同脱乙酰度的壳聚糖溶液及肉汤培养基中,使溶液中壳聚糖含量为1.0%。每24h取样,在血球板计数器上观察读数,直到所有样品和对照中的菌体数量基本不变化为止。绘制细菌的生长曲线和不同脱乙酰度壳聚糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌曲线。3结果与讨论3.1壳聚糖的抑菌活性分析表1～5数据可以看出,壳聚糖分子量对其抑菌活性有很大的影响。对于各被试菌,壳聚糖分子量与其抑菌性能大小大致成曲线关系。其总体趋势表现为低分子量的壳聚糖抑菌活性强于高分子量壳聚糖,尤其是对革兰氏阴性菌大肠杆菌和绿脓杆菌最为明显。对于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌,大分子量壳聚糖也表现出较好的抑菌活性,这是因为壳聚糖在溶液中呈无规则线团状,随着分子量的增加,其分子链的柔韧性和卷曲程度增加,同时端基减少,使得壳聚糖内消毒因子-NH2含量也略有增多,二者均使其对细菌的吸附和絮凝能力增强;但分子量太大时,溶液的粘度增加,壳聚糖分子链的卷曲和缠结程度增加,使部分消毒因子-NH2被包埋在大分子的无规则团中,影响了其对细菌的吸附及与细菌的反应能力,此时分子量较小的壳聚糖则发挥灵活运动的优势,减少了分子间氢键的形成,表现了较好的抑菌活性。另外,可能还与对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌不同的抑菌机理有关。3.2分子量壳聚糖抑菌圈直径的确定从不同浓度的壳聚糖对各被试菌的抑菌圈直径大小可以看出,无论是低分子量壳聚糖还是高分子量壳聚糖,随着浓度的不断增加,其抑菌圈直径逐渐增大。原因归结为壳聚糖中-NH2的存在,随着壳聚糖浓度的不断增加,溶液中-NH2的浓度也将增加,从而抑菌效果也增强。3.3脱乙酰度对壳聚糖抑菌性能的影响由图1、2可看出,含壳聚糖样品组的菌体的生长要比不含壳聚对照组慢,对照组在24～48h便可到达生长顶点(大肠杆菌菌体数量超过5.85×108个/mL、金黄色葡萄球菌4.8×108个/mL),而样品组要在48～96h间才达到生长顶点,且随着壳聚糖脱乙酰度(DD.)的增高,其对菌体生长的延缓作用时间也更长。随着脱乙酰度的逐渐增大,壳聚糖的抑菌能力增强,说明脱乙酰度对壳聚糖的抑菌性能有影响。这是因为壳聚糖的脱乙酰化,实际上是其分子链上亲脂性基团–NHCOCH3逐渐被亲水基团-NH2取代的过程。在酸性条件下,-NH2易与H+结合形成NH+3,随着脱乙酰度的逐渐增大,NH+3增多,对于细菌(带负电荷)的静电引力增强,更多的细菌被絮凝、聚沉,其生长繁殖也随之减慢。这也说明壳聚糖的抗菌活性与其-NH2有关,-NH2是壳聚糖的消毒因子,与我们以前的研究结论相吻合。3.4革兰氏菌抑制能力从表6可看出,壳聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用最为明显,对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抑制能力强与革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌);低分子量壳聚糖对各被试菌的最低抑菌浓度较高分子量壳聚糖的低。3.5壳聚糖的抗菌作用目前,关于壳聚糖的抑菌机理尚无定论。本试验结果表明,分子量是影响壳聚糖的抑菌、抗菌性能大小的最重要因素。无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌,低分子量的壳聚糖的抑菌作用均优于高分子量的壳聚糖。低分子量壳聚糖有一定杀菌作用,是因为分子量越小,越容易进入细胞壁的空隙结构内,干扰细胞的新陈代谢而达到杀菌目的。高分子量壳聚糖具有较强的抑菌、杀菌作用,其抗菌性能源于抗菌因子-NH+3,且高分子量壳聚糖具有很好的成膜特性,能在细胞表面形成足够致密的膜以阻止细菌的营养输入。之所以低分子量壳聚糖有较好的抗菌活性,是因为其即兼备成膜特性,又较高分子量壳聚糖易与进入细菌细胞中。另外,从我们长期的研究发现,壳聚糖的抑菌、抗菌作用还与被试菌种及其介质环境等有关。总的来说,壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑制作用比革兰氏氏阴性菌强。这可以从其细胞壁的组成来分析,革兰氏阳性菌的细胞壁较厚(15～80nm),结构紧密,且细胞壁含有丰富的磷壁酸使细胞壁形成一个负电荷环境,革兰氏阴性菌细胞的壁薄(9～11nm),交联松散。所以,高分子量壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌作用可能主要以成膜阻断营养源为主,低分子量壳聚糖对大肠杆菌的抑菌作用主要以进入细菌细胞干扰其代谢为主。我们对水溶性壳聚糖、壳寡糖的抑菌性能已经作了较为系统的研究,认为壳聚糖只有在酸性介质中(pH<6.3)才能表现出较好的抑菌活性,其抑菌活性大小顺序依次为壳聚糖、壳寡糖、水溶性壳聚糖,这可能与它们不同的作