p53表观遗传变异与肿瘤

p53表观遗传变异与肿瘤

抑制肿瘤基因p53作为一个重要的转移因素，调节了150多个基因的表达。在癌症基因激活和dna损伤等激信号的影响下，激活靶基因的dna序列特异性和激活靶基因的编码可以诱导各种生物行为。激活的p53通过调节细胞周期和诱导细胞死亡来防止肿瘤的发生。长期以来人们一直致力于探讨p53突变与肿瘤的相关性,但随着研究的不断深入,近年来越来越多的证据表明,p53表观遗传变异在肿瘤进展中同样起着非常重要的作用。表观遗传变异是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化,并最终导致了生物体表型的改变,这一理论的提出为包括肿瘤在内的多种疾病的发生机制提供了新的研究思路。研究证明翻译后p53蛋白质的磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化等表观遗传修饰对其功能具有重要影响。1mdm2的转录和活性调控泛素(ubiquitin)由76个氨基酸残基组成,高度保守,普遍存在于真核细胞内。泛素介导的是1个受严格调控的不可逆的特异性蛋白质降解途径,被降解的蛋白在El(ubiquitin-activatingenzyme,泛素激活酶)、E2(ubiquitin-conjungatingenzyme,泛素偶联酶)和E3(ubiquitinligase,泛素连接酶)的作用下与多个泛素共价结合后被蛋白酶复合体识别并降解。泛素-蛋白酶体系统的底物往往是癌基因和抑癌基因的表达产物,泛素化与去泛素化的异常改变与多种肿瘤的发生密切相关,过度泛素化导致p53、p27等抑癌蛋白的不稳定和降解是肿瘤发生发展的重要分子机制。p53是迄今发现的最重要的抑癌蛋白之一,其水平和活性受到泛素化机制的调控。p53-MDM2是p53传统的泛素化途径,人类的MDM2(mousedoubleminute2)定位于染色体12q13.14,含有核定位(NLS)与核输出(NES)序列。MDM2具有在细胞核和细胞质之间穿梭的功能,当DNA损伤等应激信号使p53活化和表达时,高水平p53又能促进MDM2的转录,MDM2的NLS序列与细胞核内的p53相结合,然后利用其NES信号,将p53运到胞质,再通过MDM2的E3-泛素连接酶活性,使p53蛋白泛素化而降解,这样就在p53与MDM2之间形成1个负反馈环,这对于维持MDM2与p53之间的平衡和生理情况下p53保持低水平表达非常重要。2007年Chen等的研究进一步完善了这一途径,证实了核孤儿受体TR3蛋白通过与p53的相互作用在转录或转录后水平调节MDM2的表达而促进凋亡的机制:当细胞内DNA损伤时,TR3对p53产生“超诱导”表达,而对MDM2产生“超抑制”效应,这显著增强了p53的生物功能,同时TR3/p53的结合不仅下调MDM2的表达,而且防止了MDM2对p53的泛素化降解,从而促进肿瘤细胞的凋亡。此外,医学界陆续又发现了一系列的非MDM2依赖途径p53泛素化酶蛋白,包括ARF-BP1(alternativereadingframe-beta-protein1,ARF-BP1)、COP1(constitutivelyphotomorphogenic1,COP1)、E4F1(E4Ftranscriptionfactor1,E4F1)等,其中最重要的是E4F1,又名pl20E4F,位于人染色体16p13.3。E4F1是1种广泛表达的锌指蛋白,是癌蛋白E1A作用的靶蛋白,不仅可对多种细胞周期蛋白进行转录后活性调节,还可以作为1个不典型的E3泛素链接酶,调控p53效应,其作用机制不同于MDM2泛素化特定的靶蛋白位点导致p53的降解,而是使p53铰链区的赖氨酸发生少量的泛素化,所产生的生物效应并不引起p53的降解,相反却引起p53信号通路的激活,最终致使细胞周期停滞,而非凋亡,这一发现表明了p53泛素化具有双重效应,对进一步研究p53的功能及细胞周期的调控具有重要意义。2磷酸化型mdm2,p33,pu蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着所有生命活动,对p53的活化起着关键性的调节作用。到目前为止,在人类细胞中已发现17个因电离辐射或紫外照射诱发的DNA损伤引起的p53磷酸化/去磷酸化位点,DNA损伤等应激信号可导致p53N端(SeI6,Ser9,Set15,Set20,Ser28,Ser33,Ser37,Ser46,Thr18)及C端(Ser392,Ser311)的氨基酸发生磷酸化。p53N端残基的磷酸化能影响p53与MDM2的结合,使得p53稳定性增强,而p53C端残基磷酸化则能增强p53与DNA中p53反应元件结合,控制着下游靶基因的表达。各位点的磷酸化由不同的应激反应所引起,ATM、CHK2等蛋白激酶参与其磷酸化过程,磷酸化的p53通过活化下游靶基因细胞周期检控点蛋白P21,产生细胞生长阻滞、凋亡或衰老效应。由于磷酸化p53在肿瘤发生机制中的重要作用,因此对p53磷酸化的分子机制一直是肿瘤防治研究的热点。近年在p53磷酸化蛋白激酶和作用位点的研究中取得了重要的进展,如当细胞DNA受到损伤时,激酶DYRK2(dual-specificitytyrosinephosphorylation-regulatedkinase2)转位到细胞核,直接使p53蛋白的Ser46磷酸化,进而诱导p53下游的促凋亡基因p53AIPI(p53-regulatedapoptosis-inducingproteinl,p53AIP1)的表达,引起细胞凋亡。另外,HlPK2(homeodomain-intereactingproteinkinase2)能通过结合并磷酸化p53蛋白的Ser46,使p53蛋白的构象发生变化,稳定性增加,并增强p53同下游凋亡相关基因启动子的亲和力,调控下游基因的转录。3对p33的泛素化作用乙酰化对p53依赖的细胞凋亡反应很重要,DNA损伤后,细胞会募集乙酰转移酶,这些分子将1个或多个乙酰基加到p53上。乙酰化的p53稳定性和特异性结合DNA序列的能力均增强,介导p53赖氨酸的乙酰化转移酶及相应位点包括p300/CBP(CREB-bindingprotein)乙酰化的Lys305、Lys373和Lys382位点,PCAF(p300/CBP-associatedfactor)乙酰化的Lys320位点,同时CBP和p300还可使MDM2乙酰化,这一作用降低了MDM2对p53的泛素化作用,提高了p53的稳定性。反过来,MDM2可泛素化并降解PCAF,也可抑制p300/CBP对p53的乙酰化作用。另外,大部分已发表的文献认为p53的去乙酰化会导致p53泛素化降解作用增强,能对p53进行去乙酰化作用的酶包括组蛋白去乙酰化酶(HDACs)、SIR2(silentinformationregulator2)等。乙酰化/去乙酰化作用对p53的活化或降解有重要影响。应激反应时,C端的乙酰化位点也是MDM2对p53的泛素化修饰位点,可见乙酰化可以阻止泛素化、稳定p53,由此说明p53与MDM2的平衡除了负反馈方式调控外,乙酰化/去乙酰化是另外1种调控途径。因此,通过调控p53乙酰化/去乙酰化状态可以影响其对下游靶基因的作用。研究发现生长抑制因子家族成员ING(inhibitorofgrowth,ING)能够与组蛋白乙酰转移酶/去乙酰化酶等结合而调控着p53乙酰化状态,从而参与抑制细胞生长,诱导细胞凋亡和DNA损伤修复。ING蛋白对p53的调控主要通过3种方式:①ING1、ING2能够将组蛋白乙酰转移酶或组蛋白去乙酰化酶等募集到p53靶分子的启动子区,使染色质变松散;②ING1、ING2结合组蛋白乙酰转移酶至p53蛋白,促进p53乙酰化;③ING1能够抑制p53去乙酰化酶SIRT1对p53的去乙酰化修饰。此外,ING1还可以与p53的泛素连接酶HDM2竞争与p53的结合,从而降低HDM2对p53的泛素化降解,稳定p53的蛋白质含量。4甲基转移酶smyd2对p33细胞增殖的影响所谓DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,Dnmt)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上的过程。甲基化状态的改变是致癌作用的1个关键因素,它包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化程度的异常升高,这将导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)。DNA甲基转移酶分2种:1种是维持甲基化酶-Dnmt1;另1种是重新甲基化酶如Dnmt3a和Dnmt3b,它们使去甲基化的CpG位点重新甲基化。转录因子p53同其他蛋白质一样,翻译后有极为丰富的加工与修饰,甲基化修饰是新发现的1种p53活性调控方式,对p53的活性与稳定性有重要影响,如转录因子p53羧基末端的k372位点被SET9甲基化后,不但增加了p53的稳定性,而且使p53定位于核内,从而启动p53靶基因表达,导致细胞周期阻滞或引起凋亡;然而p53甲基化位点不同产生的效应却截然相反,如甲基转移酶Smyd2对p53羧基末端k370位点甲基化后,则阻遏p53蛋白与DNA的结合,从而抑制p53的转录激活功能,这一发现提示过度激活的Smyd2有可能是1个潜在的癌基因。此外,p53的活性不仅受到甲基位点的影响,还与该位点甲基化程度密切相关,赖氨酸特异性去甲基化酶(LSD1)就对体内p53蛋白K370位点甲基化程度产生影响,单甲基化K370me1具有抑制p53的功能,而二甲基化K370me2则促进p53与参与DNA损伤应答的53BP1结合,从而激活p53转录活性。正常情况下,人体的p53赖氨酸的甲基化和去甲基化处于1种动态平衡,呈可逆过程,而1个特定的、单一的赖氨酸甲基化就可以决定p53的活性,可见甲基化对p53活性的重要影响。对p53甲基化修饰的认识不但丰富了肿瘤发生机制,而且为抑制转移酶活性治疗过度甲基化(即去甲基化)引起的肿瘤提供了理论依据:核苷类DNA甲基转移酶抑制剂作用机理就是在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷,在DNA复制过程中代替胞嘧啶,竞争与Dnmts结合,从而抑制Dnmts的甲基化作用,使得已经沉默的基因重新获得活性。此外,目前医学界正在尝试应用反义寡核苷酸对DNA甲基转移酶进行抑制实验,在体外实验已经证实RNA干扰DNA甲基转移酶1基因对人膀胱癌、胆管癌等细胞的生长具有抑制效应。总之,DNA甲基化是一可逆过程,通过对p53的去甲基化,有可能达到治疗癌症的目的。表观遗传修饰对p53活性的影响在肿瘤防治中的作用已经越来越引起医学界的重视,研究证实各类修饰之间常常相互促进,乙酰化可以增强p53的活性,并在乙酰化位点抑制p53的泛素化,从而增强p53蛋白的稳定性并调节其功能;磷酸化则主要通过减少MDM2-p53相互作用和借助辅助因子(如p300)促进乙酰化来影响p53的泛素化;甲基化的Lys残基招募乙酰转移酶Tip60(含