穿破石总黄酮对两种肝纤维化模型大鼠的影响

穿破石总黄酮对两种肝纤维化模型大鼠的影响

穿过岩石是属于桑蚕科的哲类植物（cudraniacon）。udoetmasam或慈姑的cudroniaticussipam的根具有活血、祛瘀、止痛的功效。它也可以用来治疗肝炎和黄黄疸。为探讨穿破石抗肝纤维化的作用机理,现对穿破石总黄酮(totalflavonesofCudraniacochinchinensis,TFC)抗肝纤维化开展实验研究。1材料表面1.1桑科植物构胶根穿破石,采自广西龙虎山,挖出植物根部,除去须根,洗净,切段晒干备用。经本所生药室梁定仁主任鉴定,为桑科植物构棘的根。猪血清,新鲜猪血购自南宁肉联厂,冷冻离心,取上清液层,经过滤灭菌,备用。1.2实验动物Wistar大鼠100只,雌雄各半,分笼饲养,由广西医科大学动物中心提供。1.3检测试剂和检测试剂丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙二醛(DMA)、超氧化物岐化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所,CCl4购自南宁市医药总公司。1.4r低温高速离心紫外可见分光光度计(美国贝克曼公司);64R低温高速离心机(美国贝克曼公司);ZS83-1型内切式组织匀浆机(浙西机械厂),半自动生化分析仪(美国贝克曼公司)。2方法2.1黄酮含量的测定穿破石经蒸馏水多次抽提,水提液过3250吸附树脂层析柱,洗脱后,经减压浓缩,冷冻干燥得总黄酮部位,以芦丁为标准,利用分光光度计测定各组分的黄酮含量,黄酮含量组为42%。2.2疗效实验2.2.1动物组100只大鼠随机分为10组,每组10只,其中50只用于化学损伤模型实验,另外50只用于免疫模型实验。2.2.2模型造模和给药分穿破石高、中、低三个剂量组、模型组和空白组。除空白组外,其余各组均按体重腹腔注射40%CCl4花生油溶液,每周2次,造模同时也开始给药,穿破石高、中、低三个剂量组每天按体重10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg总黄酮灌胃给药1次,模型组和空白组按体重灌胃等量蒸馏水。2.2.3造模、给药、造模和培养方法分穿破石高、中、低三个剂量组、模型组和空白组。除空白组外,其余各组均腹腔注射无菌猪血清(0.5ml/只/3天),造模同时也开始给药,穿破石高、中、低三个剂组每天按体重10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg总黄酮灌胃给药1次,模型组和空白组按体重灌胃等量蒸馏水。2.2.4mda、sod检测(1)8周后,麻醉大鼠,腹腔动脉采血,分离血清,用赖氏法测ALT和AST。(2)取大鼠肝脏置冰生理盐水洗净血液,滤纸吸去水分后称重,用PH7.4的PBS按1∶10稀释冰浴下匀浆,4000r/min离心5min,取上清液,按试剂盒操作说明检测MDA、SOD含量。(3)取大鼠右小叶肝脏,剪取约0.5cm厚度肝组织,中性甲醛缓冲液固定,石蜡包埋,切片为5μm厚度。经多级酒精脱水,二甲苯透明,作HE染色,天狼猩红染色。2.3处理数据计数资料用t检验,等级分组资料用Riddit分析。3结果3.1造模前后alt和ast活性的变化在化学损伤模型中,模型组与空白组有显著性差异(P<0.01),表明造模成功。而给药组能显著降低ALT活性,不同程度降低AST活性。而在免疫模型实验中,模型组与空白组并无统计学差异,各给药组对指标影响并不明显,结果见表1。3.2少mda含量的影响在化学损伤模型中,总黄酮可不同程度减少MDA的含量,增加SOD活性。但在免疫模型中只在一定程度上增加SOD活性,对MDA的影响不大,结果见表2。3.3tfc对大鼠肝组织切片的影响光镜下观察,纤维组织增生情况以“++++”为最严重,“-”为无纤维增生。正常组大鼠肝组织切片显示无肝纤维化形成,模型组纤维增生明显,说明两种模型已造模成功,TFC各组对化学损伤模型均有不同程度改善,但对免疫模型的影响并不大。其中对化学损伤模型中的TFC高剂组可明显降低大鼠纤维增生(P<0.01)。各组的Riddit分析的R值见表3。4两种模型的对比CCl4所致肝纤维化模型属化学损伤类型的肝纤维化模型。主要是由于CCl4在肝脏中经肝微粒体细胞色素P450代谢,生成可攻击内质网膜上磷脂分子的三氯甲基自由基,从而引起内质网膜脂质过氧化,进而引起膜结构和功能的破坏,同时由于CCl4抑制细胞膜和微粒体膜钙泵的活性,钙内流增加,最终导致细胞死亡。而猪血所诱导的免疫型肝纤维化模型,主要是由于血清引起机体产生可溶性免疫复合物,激活补体,并与肝细胞表面Fc受体结合而沉积于细胞膜,导致肝细胞发生免疫调节功能紊乱。血清ALT、AST指标反映肝损伤的程度,而MDA是脂质过氧化的主要降解产物,即可显示肝脏脂质过氧化水平,又能反过来损伤肝细胞膜结构,导致肝细胞进一步损伤。作为正面影响,SOD能催化自由基进行歧化反应,使自由基不能与膜脂质和蛋白发生二次反应,阻止自由基破坏肝细胞。通过对比两种模型的实验数据,在两种模型均已成模的情况下,穿破石总黄酮对于化学损伤型肝纤维化大鼠有保护作用,而对免疫型肝纤维化程度的影