药物仪器分析技术第四章 荧光光谱法

荧光光谱法第四章目录CONTENTS01基础知识02荧光分光光度计03实用分析技术04实训七

荧光分光光度法测定维生素B2案例导入

维生素C又名抗坏血酸，是维持机体正常生理功能的重要维生素之一，而人体不能自身合成维生素C,只能从食物和药物中摄取。抗坏血酸在氧化剂的作用下，被氧化成脱氧抗坏血酸，脱氧抗坏血酸可与邻苯二胺作用生成荧光化合物。因此，可通过对体系荧光强度的测定进行维生素C的定量分析。基础知识第一节011.能说出荧光光谱的产生机理。2.能说出荧光光谱与激发光谱的关系。3.能选择正确的测量条件。学习目标若在化学反应中，产物分子吸收了反应过程释放的化学能而被激发发光称为化学发光；有酶类物质参加的生物体内的化学发光称为生物发光；物质的分子因吸收光能而被激发发光称为光致发光。当光（通常为紫外光或X射线）照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的光（通常为可见光），而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。荧光光谱是一种发射光谱。根据物质的荧光波长可确定物质分子具有某种结构，从荧光强度可测定物质的含量，这就是荧光分析法。能发射出荧光的物质称为荧光物。概述011.荧光分析法的概念概述011.荧光分析法优点(1)测定灵敏度高(2)选择性好(3)用样量少(4)方法简便(5)工作曲线线性范围宽优点荧光分析仪(1)分子激发态物质分子中存在着一系列电子能级，而每个电子能级中又包含一系列的振动能级和转动能级。大多数分子含有偶数个电子，在基态时，这些成对电子自旋方向相反，填充在能量最低的轨道中。当基态分子中的一个电子吸收光辐射后，被激发跃迁至较高的电子能级且其自旋方向不变，此时，分子所处的激发态称为单线第一电子激发态；如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，此时，分子所处的激发态称为三重态。单线第一电子激发态与三重态的区别在于电子自旋方向的不同且三重态的能量稍低一些。基本原理021.荧光分子的产生机理(2)荧光分子的产生物质分子吸收紫外光或可见光后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级，变成激发态分子，激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态，如图所示。基本原理022.基本原理

1.荧光分子的产生机理光能吸收

、转换及发射示意图(2)荧光分子的产生1)振动弛豫。在溶液中，处于激发态的分子与溶剂分子碰撞，将部分振动能量传递给溶剂分子，以10-13~10-11秒的速度返回同一分子激发态的最低振动能级上，这一过程称为振动弛豫。由于能量不能以光能的形式释放，所以振动弛豫属于无辐射跃迁。基本原理022.基本原理

光能吸收

、转换及发射示意图1.荧光分子的产生机理(2)荧光分子的产生2)内转换。激发态分子将部分能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。因能量不是以光能的形式释放，而是以热能的形式释放，所以内转换也属于无辐射跃迁。基本原理022.基本原理

1.荧光分子的产生机理光能吸收

、转换及发射示意图(2)荧光分子的产生3)荧光发射。处于激发单重态最低振动能级的分子，如以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，此过程称为荧光发射，这时的发射光称为荧光。基本原理022.基本原理

1.荧光分子的产生机理光能吸收

、转换及发射示意图(2)荧光分子的产生4)系间窜跃。处于激发单重态的分子由于电子自旋方向的改变，跃迁回到同一激发态的三重态的过程称为系间窜跃，系间窜跃也是无辐射跃迁。对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。如果较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠或分子中有重原子（如I、Br等）存在，系间窜跃则较为常见。基本原理022.基本原理

1.荧光分子的产生机理光能吸收

、转换及发射示意图(2)荧光分子的产生5)磷光发射。分子经系间窜跃后，再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级，此过程称为磷光发射，这时发出的光称为磷光。由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，所以，磷光的波长比荧光更长。基本原理022.基本原理

1.荧光分子的产生机理光能吸收

、转换及发射示意图(2)荧光分子的产生6)猝灭。猝灭是指处于激发态的分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用，发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失的现象。基本原理022.基本原理

1.荧光分子的产生机理光能吸收

、转换及发射示意图(3)荧光寿命当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e时所需的时间称为荧光寿命。利用不同化合物荧光寿命的差别，可以进行荧光混合物的分析。基本原理022.基本原理

1.荧光分子的产生机理(1)激发光谱激发光谱是通过固定发射出的荧光波长，扫描激发光波长而获得的荧光强度（r）与激发光波长(λex)的关系曲线，如图所示。激发光谱反映了在一个固定的荧光波长处，不同波长的激发光激发荧光的效率。激发光谱可用于荧光物质的鉴别，并在进行荧光测定时选择合适的激发光波长。基本原理022.激发光谱与发射光谱硫酸奎宁的激发光谱与荧光光谱(a)激发光谱(b)荧光光谱(2)发射光谱发射光谱又称荧光光谱,是通过固定激发光的波长和强度，扫描发射出的光波长所获得的荧光强度（r）与荧光波长(λem)的关系曲线，如图所示。如发射出的光是磷光，则称为磷光光谱。发射光谱反映了在相同的激发条件下，不同荧光（或磷光）波长处分子的相对发光强度。发射光谱也可用于荧光物质的鉴别，并在进行荧光测定时选择合适的测量波长。基本原理022.激发光谱与发射光谱硫酸奎宁的激发光谱与荧光光谱(a)激发光谱(b)荧光光谱(3)荧光光谱与激发光谱的关系1)荧光光谱形状与激发光波长无关由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到哪种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。因此荧光光谱只有一个发射带（特殊情况除外），且光谱的形状与激发光的波长无关。基本原理022.激发光谱与发射光谱(3)荧光光谱与激发光谱的关系2)荧光的波长比激发光的波长长由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后，先经无辐射跃迁（振动弛豫、内转换）损失掉一部分能量，到达第一电子激发态的最低振动能级，再由此发出荧光；因此，荧光发射能量比激发光能量低，荧光的波长比激发光的波长长。基本原理022.激发光谱与发射光谱(3)荧光光谱与激发光谱的关系3)荧光光谱与激发光谱成镜像关系物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，因此，从理论上说，荧光化合物的激发光谱形状应与它的荧光光谱的形状完全相同。然而实际并非如此，由于存在着测量仪器或测量环境的影响，绝大多数情况下，激发光谱与荧光光谱两者的形状有所差别。只有在校正仪器因素和环境因素后，两者的形状才相同。如果把某种物质的荧光光谱和它的激发光谱相比较，便会发现两者之间存在着“镜像对称”关系。基本原理022.激发光谱与发射光谱

（1）荧光效率（2）分子结构（3）荧光物质浓度（4）环境因素基本原理023.影响荧光强度的因素不同样本间的荧光强度对比图(1)荧光效率荧光效率是指发射荧光的分子数与总的激发态分子数之比，也可定义为物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数之比，常用φ表示。如果一段时间内所有的激发态分子都将以发射荧光的方式回到基态，这一体系的荧光效率就是1,任何物质的φ均不可能大于1,而在0~1之间。基本原理022.基本原理

3.影响荧光强度的因素（２）分子结构物质分子能产生荧光必须具备两个条件：１）物质分子有强的紫外或可见光的吸收。２）有一定的荧光效率。研究表明，具有大π键共轭体系结构分子、有供电子取代基的芳香族化合物和刚性平面结构的分子有利于荧光发射，且共轭体系越长、供电子能力越强、刚性和共平面性越好，荧光越强。基本原理022.基本原理

3.影响荧光强度的因素（３）荧光物质浓度实验结果表明，荧光强度Ｆ正比于被荧光物吸收的光强度。依据朗伯－比尔定律和数学关系的推导，当荧光物质浓度很小（Ａ≤0.05）时，荧光强度Ｆ与荧光物质的浓度有如下关系：式中，为激发光强度；

为摩尔吸光系数；为荧光物质的物质的量浓度；为液层厚度。基本原理022.基本原理

3.影响荧光强度的因素（３）荧光物质浓度对于给定的物质来说，当激发光的强度和液层厚度一定时，均为定值可得出：式中，Ｋ为常数。由此可见，在实验条件（如温度、激发光的波长、强度和液层厚度等）固定和低浓度情况下，荧光物质的荧光强度与其溶液的浓度呈线性关系。这是荧光物质定量分析的理论基础。基本原理022.基本原理

3.影响荧光强度的因素（４）环境因素溶液中的环境因素对荧光分子可能产生强烈的影响。１）温度的影响温度对于溶液的荧光强度有显著的影响。在一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低。２）溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都可能会有显著的差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。基本原理022.基本原理

3.影响荧光强度的因素３）ｐＨ值的影响假如荧光物质是一种弱酸弱碱盐，溶液的ｐＨ值改变将对荧光强度产生很大的影响。这主要是因为弱酸、弱碱分子和它们的离子结构有所不同，在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度也有差异。４）其他影响此外还有如散射光、溶解氧、荧光猝灭剂等环境因素，通过影响荧光效率或荧光物质的结构从而影响荧光物质发光强度。基本原理022.基本原理

3.影响荧光强度的因素荧光分光光度计第一节021.能说出荧光分光光度计的工作原理与主要部件的功能。2.能完成简单的仪器维护。3.能完成荧光分光光度计的仪器校正。学习目标荧光分光光度计和紫外－可见分光光度计的构造基本上是相同的。仪器包括四个主要部件：·激发光源·单色器·样品池·检测器构造与工作原理01１.工作原理荧光分光光度计构造与工作原理01由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤和反射后，被光电倍增管所接收，然后以图或数字的形式显示出来。１.工作原理荧光分光光度计构造示意图（１）激发光源对激发光源主要考虑其稳定性和强度，因为光源的稳定性直接影响测量的重复性和精确度，而光源的强度又直接影响测定的灵敏度。构造与工作原理01２.主要部件氙灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在２５０～７００ｎｍ；高压汞灯发射３６５ｎｍ、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、５４６ｎｍ、５７９ｎｍ、６９０ｎｍ和７３４ｎｍ的线状谱。测量中常用３６５ｎｍ、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ三条谱线。荧光测量中常用的光源包括高压汞灯或氙灯（２）样品池荧光分析的样品池是用低荧光、不吸收紫外光的石英材料制成的，形状为方形或矩形。荧光样品池四面透光，不同于紫外吸收池两对面透光，这样也有利激发光和荧光的双向透过。构造与工作原理01２.主要部件（３）单色器荧光分析仪器有两个单色器，激发单色器（第一单色器）和荧光（发射）单色器（第二单色器）。构造与工作原理01２.主要部件第一个单色器的作用是将不需要的光除去，使需要的激发光透过而照射到样品池。第二个单色器将由激发光所发出的反射光、瑞利散射光、拉曼散射光和溶液中杂质产生的大多数荧光滤去。采用滤光片做单色器的一般称为滤光片荧光计，其结构简单，价格便宜，可用于已知组分样品的定量分析，但不能提供激发光谱或荧光光谱。荧光分光光度计都采用光栅分光，可以获得单色性好的激发光，并能分出某一波长的荧光，以减少干扰，而且可以扫描激发光谱或荧光光谱。（４）检测器荧光的强度通常比较弱，一般用光电倍增管作检测器，放置位置与激发光入射方向成直角，可以使背景信号为零，即使是微弱的荧光信号也能被检测到，也是其灵敏度高于一般分光光度法的原因之一。构造与工作原理01２.主要部件（１）氙灯的保养与维护·氙灯是荧光分光光度计的重要部件,正常使用寿命为500小时。·使用氙灯时应避免频繁开关,应完全冷却后再开启,关闭时让风扇继续转动一会儿。这可延长氙灯的使用寿命。·氙灯使用时间达到500小时后,应及时更换新的氙灯,以获得准确稳定的测试数据和确保仪器安全。构造与工作原理01３.维护保养（１）氙灯的保养与维护·更换氙灯前应切断电源,等待其完全冷却(约2小时),佩戴手套操作。·更换时注意接正极负极,避免眼睛直视灯光,小心操作不要碰坏灯泡。·旧的氙灯含有高压气体,应用厚布裹好后用锤头打碎,妥善处理。构造与工作原理01３.维护保养分析仪中常用的氙气灯（２）样品室的保养与维护在使用中，样品室的污染是经常会遇到的，如不采取必要的措施，会直接影响到测试的正常进行，严重时甚至会造成仪器损坏，所以需要特别注意保护样品室不受样品污染。通常来说，有以下五种污染：固体污染、液体污染、气体污染、指纹污染、水汽污染。构造与工作原理01３.维护保养·固体污染。主要是粉末污染。例如，高发光效率的发光粉末落在样品室，如果测量弱发光样品的时候就会干扰测试，需要特别留意。夹好的样品放入前，用洗耳球吹一下，可以减少洒落。构造与工作原理01３.维护保养洗耳球·液体污染。在取放样品时，样品池中的液体若不小心溅到样品室里，要及时进行清洗。·气体污染。具有腐蚀性的酸性气体对光学元件的污染是不可逆的，直接影响仪器的使用寿命。在测试此类气体时，样品室需要和周边的光学元件隔离，采用光学窗口保证测试正常进行。构造与工作原理01３.维护保养·指纹污染。当狭缝开到比较大的时候，留在样品仓上的指纹、汗液可能会发光，影响测试，因此，应在测试时戴上手套。·水汽污染。做液氮低温或变温低温时，会导致窗口表面水汽凝结，影响测量数据，可以用干燥空气或氮气吹扫样品室，驱走水汽。构造与工作原理01３.维护保养（３）光电倍增管的维护要点1.在切换光源或改变设置前,必须将狭缝调到最小,防止强光损坏光电倍增管。2.经常清洁光电倍增管外壳,保持其干净无尘。

3.操作时不要直接用手触摸外壳。4.光电倍增管的光阴极具光敏性,所有操作必须在弱光条件下进行。5.超过容许值的电流会导致光阴极敏感性下降甚至损坏。构造与工作原理01３.维护保养（４）常见事故排除除了对仪器进行保养维护以外，也需要能够对一些简单的仪器故障进行合理的判断和维修。本篇罗列四种常见问题的排除方式，分别是：荧光分光光度计开机自检不通过、测试数据不稳定、无结果显示与氙灯未点亮。构造与工作原理01３.维护保养１）荧光分光光度计开机自检不通过主机与计算机连接电缆没接好，重新连接；计算机系统出错，关机重新开启；电机故障，联系技术工程师维修。

２）测试数据不稳定光源不稳定，查看氙灯的使用记录，看是否快到或者已到额定寿命，如果是，则更换新灯；测试样品本身不稳定。构造与工作原理01３.维护保养３）无结果显示无激发光源，查看氙灯是否被点亮，如果氙灯已被点亮，查看狭缝是否关闭；信号传输线断开，联系技术工程师维修；样品没有荧光，或者荧光太弱，检测不到；样品有荧光，只是因为测量参数（比如激发波长、扫描范围等）设置错误而导致测不到峰，重新设置测量参数。构造与工作原理01３.维护保养４）氙灯未点亮主机电源是否接通；断开电源后查氙灯的保险丝，如已断，更换新保险丝；氙灯损坏，更换新的氙灯。构造与工作原理01３.维护保养临床应用荧光分光光度计的灵敏度受许多因素影响，如激发光源的光强度、单色器性能、放大系统、所用测定波长、溶剂的散射、杂质荧光等。02荧光分光光度计校正１.灵敏度校正荧光分光光度计的灵敏度会受多种因素影响而变化,如激发光源、单色器、放大系统、测定波长等。即使同一台仪器,在不同时间的测定结果也会有差异。因此在每次测定前,需要采用标准荧光溶液(如奎宁或荧光素)进行仪器校准。配制浓度一致的标准溶液,在选定波长和狭缝条件下,调节测得的荧光强度到一个固定值。如果被测物质荧光稳定,也可以用其自身溶液作为标准校准仪器。

荧光分光光度计在出厂前已经进行过波长校准,但长期使用后或者重要部件更换后还需要重新校准。采用汞灯标准谱线对单色器波长刻度进行重新校正,这在要求高的测定工作中很重要。稀土镨钕玻璃和钬玻璃可用于校准,它们在宽波长范围内有特征吸收峰。02２.波长校正荧光分光光度计校正

一般采用镨钕玻璃573nm和586nm双峰以及741nm和808nm吸收峰校准可见光范围。可见光范围内允许的波长误差为±3nm。氘灯和汞灯可用于紫外分光光度计校准。苯蒸气也可用于紫外范围校准。02２.波长校正荧光分光光度计校正３.光谱校正荧光分光光度计测得的激发光谱和荧光光谱往往存在误差,原因是光源强度和检测器响应随波长变化不同。单光束仪器由于没有参比校正,测定的光谱误差较大,特别是在检测器响应曲线陡变区域。具体校正方法是:先用校正装置调整各波长光源强度一致,然后依据检测器响应曲线校正表观光谱。02荧光分光光度计校正３.光谱校正双光束光路的仪器可以用参比光束抵消光学误差。应定期用标准光源和样品对仪器进行校正,确保光谱测定的准确性。操作时切记在检测器响应曲线陡变处力求减小误差。02荧光分光光度计校正实用分析技术第一节031.能说出标准曲线法进行物质含量测定流程。2.能说出标准对照法进行物质含量测定的流程。学习目标荧光分光光度法比紫外－可见分光光度法灵敏度更高、选择性更好，应用也极其广泛，尤其对生物大分子的检测效果更好，另外还可作为液相色谱的检测器。荧光分析仪是运用光的色散、消化吸收、透射等获得被解析化学物质相关信息的光谱仪，是可对化学物质成分、构造开展解析、精确测量的物理学光学设备。实用分析技术分子荧光光谱法可以测量激发光谱和发射光谱两个特征光谱,所以其定性分析可靠性更高。荧光定性分析常用直接比较法,即将试样与已知物质一起观察其荧光性质、颜色和强度，来鉴定它们是否含有同一荧光物质。可以比较固体和液体试样,也可以配制不同浓度和pH的已知物质溶液进行比较。定性分析01进行定性分析需采用纯品作对照,比较激发光谱和发射光谱的一致性。但实际中能荧光的化合物有限,且许多化合物的荧光波长相近,所以荧光光谱法很少单独用于定性分析。荧光光谱法更多是与其他方法联用,进行定性分析。定性分析01临床应用荧光光谱仪用于定性分析方法有以下几种：荧光光谱仪用于定性分析方法1.比较光谱分析法

这种方法应用比较广泛，它包括标准试样比较法和铁谱比较法。标准试样比较法一般适用于单项定性分析及有限分析。铁谱比较法不但可以做单项测定，还便于做全分析。2.谱线波长测量法

光谱分析仪器利用谱线波长测量法进行定性分析是先测出某一谱线的波长，再查表确定存在的元素，这种方法在日常分析中很少使用，一般只是在编制谱图或者做仲裁分析时才用。定性分析01荧光光谱仪定性分析可以分析70多个元素，但由于受到仪器和光源条件的限制，有些元素如非金属及卤族元素等需要在特殊的条件下才能测定。荧光光谱仪用于定性分析方法定性分析01荧光光谱仪定性分析样品种类繁多,需要选用不同的方法激发荧光。对金属样品,可以直接作为电极,用电弧光激发;也可以用火花或激光显微光源。对有机物样品,需要先进行化学处理,制成溶液后进行分析。也可以将样品处理成粉末,装入碳电极孔中,用电弧光激发分析。

荧光光谱仪定性研究的特性是方式简易、速度快、样品量少且试品都能够解析，针对绝大部分元素有较高的敏感度。定量分析02

荧光是物质在吸收光能之后发射产生的，因此溶液的荧光强度与该溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。溶液被入射光激发后，可以在溶液的各个方向观测荧光强度。但由于激发光的一部分被透过，因此在透射光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光束垂直的方向观测。夜晚的荧光跑道将已知量的标准物质经过和样品相同的处理方法处理后，配成一系列标准溶液，在一定的仪器条件下测定这些溶液的荧光强度

，作出标准曲线。然后在同样的仪器条件下，测定试样溶液的荧光强度，从标准曲线上查出它们的浓度。由于荧光光谱仪是通过对样品产生的Ｘ射线的计算强度进行测定，再通过预先建立的计算强度与元素百分含量的曲线关系，来间接测定元素的含量。02１.标准曲线法定量分析标准曲线的精确是分析结果准确的前提。（1）标准曲线的样品应当不少于５个，以１０～１５个为佳。（2）样品太少（3）样品太多定量分析02１.标准曲线法缺少代表性，回归线准确性低；容易造成误差在标准曲线制作过程中应注意以下几点：（１）为了使各次所绘制的标准曲线能重合一致，每次应用同一标准溶液对仪器进行校正。（２）在测量时，标准溶液和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。对于实际遇到的复杂分析体系，实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是溶剂空白。02１.标准曲线法定量分析（３）荧光分析仪标准样品各元素百分含量梯度的变化方向要与实际试样的变化方向一致，其含量范围要涵盖生产中可能出现的所有含量。（４）标样的细度要与生产过程中的样品细度尽量保持一致。原材料标准样品细度要与日常化学分析时细度一致。另外，样品在制作时要烘干，否则，会因水分的变化造成较大的测定误差。标准曲线样品的定值一定要准确。一般可采用３次平行测定样品，然后取其平均值，同时剔除异常值。02１.标准曲线法定量分析如果荧光物质的标准曲线通过零点，就可选择在其线性范围，用标准对照法进行测定。取已知量的纯荧光物质，配成浓度在线性范围内的标准溶液，测定其荧光强度Ｆｓ，然后在相同条件下测定样品溶液的荧光强度Ｆｘ，分别扣除空白Ｆ０，由标准溶液的浓度ｃｓ和两个溶液的荧光强度比，求出样品中荧光物质的浓度ｃｘ。02２.标准对照法定量分析若多组分的荧光光谱不重叠，可选用不同的发射波长分别测定各组分的荧光强度，再采用单组分定量方法定量。若两组分的荧光光谱峰相近，甚至重叠，而激发光谱有差别，可选用不同的激发波长来进行测定。02２.标准对照法定量分析03１.无机物荧光分析定量分析示例无机物荧光分析的方法直接荧光法间接荧光法荧光猝灭法催化荧光法（１）直接荧光法无机化合物能自身产生荧光用于测定的比较少，主要依赖于待测元素与有机试剂组成的能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度来测定该元素的含量，这种方法称为直接荧光法。02１.无机物荧光分析定量分析（２）间接荧光法许多有机物和无机化合物本身不发荧光或荧光效率很低,不能直接测定,需要采用间接荧光法。间接荧光法常用于测定某些阴离子,它们可以从金属有机配合物中取代荧光配体。常用的间接荧光法是荧光衍生法,将待测物转化为能发荧光的物质后测定。荧光衍生法按反应类型可分为化学衍生、电化学衍生和光化学衍生法,最常用的是化学衍生法。02１.无机物荧光分析定量分析（３）荧光猝灭法某些元素虽不与有机试剂组成会发荧光的配合物，但它们可以从其他会发荧光的金属离子－有机试剂配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，通过测定降低的程度来测定该元素的含量，这种方法称为荧光猝灭法。02１.无机物荧光分析定量分析（４）催化荧光法某些反应的产物虽能产生荧光。但反应速率很慢，荧光微弱，难以测定。在某些金属离子的催化作用下，反应可加速进行，利用这种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。铜、铍、铁、钴、锇、银、金、过氧化氢及氰离子等都可采用这种方法测定。02１.无机物荧光分析定量分析

02２.有机物荧光分析定量分析（１）脂肪族化合物脂肪族化合物的分子结构较为简单，本身能产生荧光的很少，如醇、醛、酮、有机酸及糖类。但也有许多脂肪族化合物与某些有机试剂反应后的产物具有荧光性质，此时就可通过测量荧光化合物的荧光强度进行定量分析。02２.有机物荧光分析定量分析（２）芳香族化合物芳香族化合物具有共轭不饱和结构，大多能产生荧光，可以直接进行荧光测定。有时为了提高测定方法的灵敏度和选择性，还常使某些弱荧光的芳香族化合物与某些有机试剂反应生成强荧光的产物进行测定。02２.有机物荧光分析定量分析实训七

荧光分光光度法测定维生素Ｂ２第一节04１能说出标准曲线法定量分析维生素Ｂ２的基本原理。２能完成荧光分光光度计的基本操作方法。３能说出荧光分光光度计的基本原理、结构及性能。01实训目的维生素Ｂ２（核黄素）是橘黄色无臭的针状结晶。其结构式为：02实验原理维生素Ｂ２的理化性质维生素Ｂ２的理化性质分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。在pH值为6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素Ｂ２溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素Ｂ２的含量。02实验原理在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素Ｂ２的荧光强得多，故测维生素Ｂ２的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。02实验原理维生