单线态和三线态

光谱分析原子光谱原子吸收原子发射原子荧光分子光谱分子吸收紫外-可见光谱分子发光2021/5/91第二章分子发光分析分子吸收能量激发为激发态释放出能量基态电能化学能光能称为“发光”光的形式释放荧光磷光分子发光光致发光化学发光辐射跃迁非辐射跃迁以热的形式释放2021/5/92

分子荧光分析法一、基本原理（一）荧光和磷光的产生

从分子结构理论来讨论分子中电子的能量状态电子所处的能级振动能级转动能级电子的多重态J=2S+1S：为各电子自旋量子数的代数和S=0,J=1单重态S表示（所有电子都是自旋配对的）S=1,J=3三重态T表示大多数基态分子都处于单重态电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化（自旋平行）2021/5/93基态单重态S激发态单重态S激发态三重态T激发单重态S与激发三重态T的不同点：⑴

S是抗磁分子，T是顺磁分子⑵

tS=10-8s,tT=10-4～1s；(发光速度很慢)⑶

基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；⑷

激发三重态的能量较激发单重态的能量低2021/5/94其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。

2．分子内的光物理过程2021/5/95S0S1S2T1吸光

1吸光

2振动弛豫:在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。非辐射能量传递过程；2021/5/96S0S1S2T1吸光

1吸光

2内转移:

当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。（S1转移S2）2021/5/97S0S1S2T1吸光

1吸光

2荧光

3系间窜跃:指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。2021/5/98辐射能量传递过程荧光发射:电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态

S0S1S2T1吸光

1吸光

2荧光

3荧光得到最大波长为λ3的荧光由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小

λ3>λ2

>λ12021/5/99磷光发射:

电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。S0S1S2T1吸光

1吸光

2荧光

3磷光磷光2021/5/910外转移

指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。荧光与磷光的根本区别：

磷光是由激发三重态最低振动能层至基态荧光是由激发单重态最低振动能层至基态区别2021/5/911(二)荧光的激发光谱和发射光谱

激发光谱:(ex)以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧光最强的波长处测量荧光强度即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线。发射光谱：(em)固定激发光波长（最大）然后测定不同的波长时所发射的荧光强度即可绘制荧光发射光谱曲线2021/5/912在荧光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。2021/5/9132021/5/914激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移

激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光c.镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。

2021/5/915（三）荧光的影响因素分子产生荧光必须具备两个条件：①分子必须具有与所照射的辐射频率(紫外-可见光）相适应的结构（共轭双键），才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。2021/5/9161.荧光效率它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示

荧光效率越高；物质发射荧光越强kf为荧光发射过程的速率常数（与化学结构有关）

ki为其它有关过程的速率常数的总和（化学环境）凡使kf

值升高而使ki值降低的因素，都可增强荧光。2021/5/9172.荧光与有机化合物结构的关系（1）跃迁类型实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历

激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生

跃迁而得到荧光。（2）共轭效应实验证明，容易实现

激发的芳香族化合物容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子2021/5/918(3)刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。2021/5/919（4）取代基效应芳环上取代基给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团减弱甚至会猝灭荧光如-COOH、-NO、-C

O、卤素卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率2021/5/9203.金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。但是，若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光2021/5/9212021/5/922

同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。4．溶剂效应一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*

跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。5．温度的影响一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。2021/5/923（四）溶液的荧光（或磷光）强度1.荧光强度与溶液浓度的关系

荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率

。

If=

Ia式中

为荧光量子效率，又根据Beer定律A=-lgI/I0I=I0.10-A

Ia=I0-I=I0(1-10-A)I0和I分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得

If=

I0(1-10-kbc)2021/5/924整理得：

If=2.3

I0

kbc当入射光强度I0和b一定时，上式为：

If=Kc即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当kbc0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。

2021/5/9252、影响荧光强度的环境因素因素溶剂一般溶剂效应折射率和介电常数的影响特殊溶剂效应荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用如氢键的生成同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同温度温度上升使荧光强度下降内部能量转化作用增大碰撞频率增加，使外转换的几率增加酸度化合物所处状态不同电子构型上有所不同荧光强度和荧光光谱不同2021/5/9262021/5/9273、荧光猝灭定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子

的相互作用引起荧光强度降低的现象类型碰撞猝灭激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态静态猝灭荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的络合物转入三重态的猝灭发生电子转移反应的猝灭猝灭剂与荧光物质荧光物质的自猝灭浓度较高单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭溶解氧与荧光物质2021/5/928光源氙灯和高压汞灯激发单色器光栅扫描激发光谱，选择激发波长样品池I0

IIf发射单色器扫描发射光谱消除其它光线的干扰获得所需的荧光检测器显示器与分光光度计的差别两个单色器两个单色器互成直角光电倍增管二、荧光分析仪2021/5/929三、分子荧光分析法及其应用1.荧光分析方法的特点（1）灵敏度高（2）选择性强（3）试样量少和方法简单（4）提供比较多的物理参数2、荧光定量分析的方法方法标准曲线法荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系比较法同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液的荧光强度，直接通过比例计算2021/5/9303、荧光分析法的应用方法直接荧光法被测物本身有荧光被测物与试剂反应后F与物质的浓度成正比荧光猝灭法被测物使荧光熄灭由荧光强度降低的强度来测定被测物的含量

间接荧光法某些阴离子夺取金属络合物中金属离子，而释放出能发荧光的配位体催化荧光法反应速度慢，荧光微弱，难测定金属离子将加速反应进行2021/5/931磷光分析法

1．如何获得较强的磷光增加试样的刚性: 低温冷冻固体磷光法：

吸附于固相载体（滤纸）分子缔合物的形成：

加入表面活性剂等重原子效应：

加入含重原子的物质，如银盐等敏化磷光：

通过能量转移产生磷光

磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级

→基态，

T1

→

S0跃迁；

电子由S0进入T1的可能过程：（

S0

→

T1禁阻跃迁）2021/5/932

荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光磷光分析仪器应用2021/5/933化学发光分析法一、基本原理A+B→

C+D*D*→D+h

某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物（2）发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当

E=170～300kJ/mol；位于可见光区（3）发光持续时间较长，反应持续进行发光反应如果存在于生物体(萤火虫)中，称生物发光2021/5/934化学发光效率化学效率：发光效率：化学反应所决定

化学反应和环境因素化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt是分析物参加反应的速率

2021/5/935若化学发光反应是一级动力学反应则即发光总强度与被测物浓度成线性：二、化学发光反应类型1.直接化学发光和间接化学发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子

A+B

C*+DC*

C+h

2021/5/936间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。A+B

C*+DC*+F

F*+EF*

F+h

2.气相化学发光和液相化学发光（1）气相化学发光化学发光反应在气相中进行

主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等

NO+O3

→NO2*NO2*→NO2+h

2021/5/937（2）液相化学发光

化学发光反应在液相中进行应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺-H2O2发光反应反应速度慢，可检测低至10-9mol/L的H2O2；2021/5/938生物发光生物发光是化学发光中的一类，特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。多种细菌、昆虫、鱼类等均能发光2021/5/939荧光灯：当高压加在灯管两端后，灯管内少数电子高速撞击电极后产生二次电子发射，开始放电，管内的水银受电子撞击后，激发辐射出253.7nm的紫外光，产生的紫外光激发涂在管内壁上的荧光粉而产生可见光。

（可见光的颜色将依据所选用的荧光粉的不同而不同）

2021/5/940荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。

2021/5/941三、化学发光的测量仪器仪器主要包括：

样品室、光检测器、放大器和信号输出装置等部件2021/5/942荧光法测定维生素B2片剂中核黄素含量

一、实验目的：1．学习和掌握荧光光度分析方法2．了解荧光分光光度计的结构及使用方法二、实验原理：维生素B2结构式

维生素B2，又叫核黄素，橘黄色,无臭的针状晶体易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂在中性或酸性溶液中稳定光照易分解，对热稳定2021/5/943维生素B2水溶液在430-440nm蓝光或紫外光照射下会发生绿色荧光，荧光峰在535nm,在pH=6-7溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱溶液中荧光消失，所以可以用荧光光谱法测定维生素Ｂ2的含量三、实验用品：1．仪器：荧光分光光度计，移液管，容量瓶，棕色试剂瓶，比色管，烧杯，离心机，离心管2．药品：核黄素（生化试剂），冰醋酸（AR）,盐酸（AR）氢氧化钠，市售维生素B2片剂2021/5/944四、实验步骤：1、试剂溶液的配制1）5％醋酸溶液

取5份冰醋酸与95份体积蒸馏水混合

2）10.0