经典液相色谱法课件

第18章经典液相色谱法汇报人：某某某汇报时间：2023.X.X目录CONTENTS18.1概述18.2液-固吸附柱色谱法18.3离子交换柱色谱法18.4平面色谱参数18.5薄层色谱法18.7应用与示例18.6纸色谱法18.1概述定义普通规格的固定相、常压输送流动相，往往不具备在线检测器。液相色谱法又可以分为柱色谱法和平面色谱法。01特点仪器设备简单，成本费用低，分析速度快，能同时分析多个样品，对样品预处理的要求不高，试样不受沸点、热稳定性的限制。02应用医药工业中样品的制备和纯化、药品的纯度控制和杂质检查、天然药物研究中有效成分分离、中药的定性鉴别、药物筛选、临床检验和生物化学中各种样品的分析。03济众酊质量标准草案

济众酊JizhongDing【处方】樟脑12g薄荷脑6g肉桂10g

砂仁10g辣椒2.5g大黄10g

广藿香40g干姜30g小茴香30g【制法】以上九味，樟脑、薄荷脑用适量乙醇溶解，其余砂仁等七味照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法（《中国药典》2005版一部附录IO），用70％乙醇作溶剂进行渗漉，收集渗漉液约900ml，压出药渣中的溶剂，合并，加入樟脑、薄荷脑的乙醇溶液，加70％乙醇使成980ml，静置，滤过，加乙醇使成1000ml，混匀，即得。大黄的TLC鉴别：

取本品30ml，加水10ml，用乙醚提取3次，每次10ml，合并乙醚层，7水浴蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理25分钟，滤过，挥干至2ml作为对照药材溶液。另取缺大黄的阴性样品，按供试品制备方法同法制成阴性对照溶液。取大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素对照品，加乙醇制成浓度均为1.5mg/ml的溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005版一部附录VIB）试验，分别吸取上述对照品溶液和对照药材溶液各4μl，供试品溶液2μl以及阴性溶液10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（30：10：0.5）为展开剂，展开，展距约8cm，取出，晾干，置紫外灯（254nm＋310nm＋365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，且各斑点分离较好，阴性对照色谱在相应位置上无干扰。大黄TLC图谱S1：大黄酚，大黄素，大黄酸，芦荟大黄素（依次从上到下）对照品S：大黄对照药材1，2，3，4，5：供试品B：阴性对照品S1S12345B

18.2液-固吸附柱色谱法18.2.1分离原理

液-固吸附柱色谱法是以装在管状柱内的吸附剂为固定相，用液体流动相进行洗脱的色谱法。

利用吸附剂对不同组分吸附能力的大小而进行分离。

18.2液-固吸附柱色谱法吸附剂的吸附能力：

一是取决于吸附中心（吸附点位）的多少；二是取决于吸附中心与被吸附物形成氢键能力的大小。

吸附活性中心越多，形成氢键能力越强，吸附剂的吸附能力越强。18.2.2吸附剂

常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺和大孔吸附树脂等。(1)硅胶

具有硅氧交联结构，表面具有许多硅醇基（-Si-OH）的多孔性微粒。通常用SiO2·XH2O表示。

由于化合物的极性及不饱和程度不同,形成氢键的能力不同而得以分离。18.2.2吸附剂

硅胶的吸附能力与含水量有密切关系（见表17-1）,含水量低，活性级数低，吸附能力强，若含水量达17％以上，则吸附能力极低。(1)硅胶表17-1硅胶和氧化铝的含水量与活性的关系

硅胶含水量%

活性级数

氧化铝含水量%

0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15

硅胶具有微酸性，适合分离酸性和中性物质。18.2.2吸附剂

氧化铝是由氢氧化铝于400～500℃灼烧而成的一种吸附力较强的吸附剂，根据制备时pH的不同有碱性、中性和酸性三种类型。一般情况下中性氧化铝使用最多。

氧化铝的活性也与其含水量密切相关（见表17-1），水分的增加可使活性降低，称为脱活性。(2)氧化铝18.2.2吸附剂

一类由酰胺聚合而成的高分子化合物，其酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类和酸类中的羟基或羧基形成氢键吸附；酰胺基中的氨基与醌基或硝基形成氢键吸附。

由于聚酰胺与被分离物形成氢键的能力不同，产生不同的吸附力而达到分离目的。(3)聚酰胺18.2.2吸附剂

一类不含交换基团的大孔高分子吸附剂特点

理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，有良好的吸附选择性，吸附速度和洗脱速度快，容易再生，成本低等。

应用

中药有效成分和有效部位的分离纯化、中药复方的提取精制、维生素和抗生素的分离提纯、化学制品的脱色、血液的净化、食品添加剂分离精制和工业废水的处理等。(4)大孔吸附树脂18.2.3色谱条件的选择

吸附色谱的洗脱过程是流动相分子与被分离组分分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。为了使试样中吸附能力稍有差异的各组分分离，就必须同时考虑到试样中被分离组分的性质、吸附剂的活性和流动相的极性这三种因素。18.2.3色谱条件的选择(1)被分离组分的结构与性质

判断物质极性大小规律①基本母核相同，则分子中基团的极性越强，整个分子的极性也越强②分子中双键越多，吸附能力越强，共轭双键多吸附力亦增大③化合物基团的空间排列对吸附性也有影响

常见基团的极性由小到大的顺序烷烃＜烯烃＜醚类＜硝基（—NO2）＜二甲胺（—N(CH3)2）＜酯类（—COOR）＜酮（＞C=O）＜醛（—CHO）＜硫醇（—SH）＜胺类（—NH2）＜酰胺（—NHCOCH3）＜醇类＜酚类＜羧酸类。

18.2.3色谱条件的选择（２）吸附剂的选择

分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂分离极性强的物质，应选用吸附能力弱的吸附剂（3）流动相的选择18.2.3色谱条件的选择

“极性相似相溶”原则

常用的流动相极性递增的次序石油醚＜环已烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜氯仿＜醋酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水分离极性大的物质应选用极性大的溶剂作为流动相，分离极性小的物质应选用极性小的溶剂作为流动相。

色谱分离条件的一般原则组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性

为了得到适当的流动相，在实际工作中常采用多元混合流动相。

18.2.3色谱条件的选择18.3离子交换柱色谱法

分离原理

离子交换柱色谱法是以装在管状柱内的离子交换剂为固定相，流动相常用酸碱水溶液或缓冲液，

原理利用试样中电离组分对离子交换剂亲和力的不同，亲和力大的，在离子交换柱上的保留时间长，后流出柱。

应用去离子水的制备、离子型药物的分离、纯化和检测及微量元素的分离富集等。18.3.1离子交换剂分为离子交换树脂和键合离子交换剂两类

(1)键合离子交换剂

以硅胶为载体，表面经化学键合上所需的各种离子交换基团，分为强碱、弱碱或强酸、弱酸性离子交换剂。

特点

具有较高的耐压性、化学稳定性和热稳定性，主要应用于高效液相色谱中作离子交换色谱柱的填料。18.3.1离子交换剂(2)离子交换树脂

一类具有网状立体结构的高分子聚合物，最常用的是聚苯乙烯型离子交换树脂。它是以苯乙烯为单体，二乙烯苯为交联剂聚合生成的球形网状结构，并在网状骨架结构上引入不同的可以被交换的活性基团。

根据所引入的活性基团不同，可分为：

阳离子交换树脂阴离子交换树脂18.3.1离子交换剂

阳离子交换树脂

树脂骨架上引入酸性基团，如-S03H，-COOH和-OH等。这些酸性基团上的H+可以和溶液中的阳离子发生交换反应。强酸性阳离子交换树脂的交换与再生反应为交换

nR-SO3－H++Mn+(R-SO3－)nMn++nH+

再生

18.3.1离子交换剂

阴离子交换树脂

树脂骨架上引入碱性基团，如季铵基-N(CH3)3+、

胺基-NH2、仲胺基-NHCH3和叔胺基-N(CH3)2等，这些碱性基团上的OH-可以和溶液中的阴离子发生交换

反应。常用的阴离子交换树脂多为强碱型，例如季铵基阴离子交换树脂，以R-N(CH3)3+OH-表示，其交换与再生反应为

交换

nR-N(CH3)3+OH-

+Yn-(R-N(CH3)3+)nYn-+nOH-

再生

18.3.2离子交换树脂的性能交联度(degreeofcrosslinking)

树脂中交联剂所占的质量分数。交联度大，网眼就小，形成的网状结构紧密，选择性高。但网眼过小，会使交换速度变慢，甚至使体积较大的离子难以进入树脂进行交换反应。交换容量(exchangecapacity)理论交换容量是指每克干树脂内所含有的能与离子发生交换的基团数目；实际交换容量是指在实验条件下每克干树脂真正参加交换反应的基团数。薄层色谱法(thinlayerchromatographyTLC)

将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法。属于平面色谱法中的一种。18.4平面色谱参数1．定性参数

比移值（Rf）

组分的迁移距离（l）与展开剂的迁移距离（lo）之比

式中，l是由原点至某组分斑点中心（质量重心）的距离，l0是由原点至展开剂前沿的距离。Rf值的数值范围在0～1之间

当Rf值＝0时，表示该组分滞留在原点，吸附剂对它的吸附力很强；

当Rf值＝1时，表示该组分随展开剂移动至前沿，吸附剂对它基本不吸附。从分离效果考虑，Rf值的可用范围是0.2～0.8，最佳范围是0.3～0.5。

18.4.1定性参数图17-1薄层色谱Rf值示意图

用相对比移值作定性参数，可消除实验中的某些系统误差，使结果更可靠。

相对比移值（Rr）组分的迁移距离（la）与参考物的迁移距离（ls）之比

Rr＝Rf（a）/Rf(s)=la/ls

式中，la和ls分别为原点至组分a和参考物质的斑点中心的距离。18.4.1定性参数2．相平衡参数—比移值与分配系数及容量因子的关系

18.4.2相平衡参数在薄层色谱中，比移值Rf可以用流动相与组分定距展开一定距离的保留时间之比来表示上式中的t0和tR分别为流动相和组分定距展开的保留时间。将上式代入可得比移值与分配系数的关系

实验条件固定，K只与组分性质有关，即Rf只与组分性质有关，Rf是平面色谱的定性参数2．相平衡参数—比移值与分配系数及容量因子的关系

18.4.2相平衡参数将

代入比移值与容量因子的关系

在吸附和分配薄层色谱法中，主要通过改变流动相的极性，使cs/cm改变，即K或k改变，以达到改变Rf之目的。影响比移值(Rf)的因素1、被分离组分的结构和性质2、薄层板的性质（粒度、厚度、吸附剂的活性）3、展开剂的极性4、温度（湿度）5、展开槽内展开剂蒸汽饱和程度

样品和对照品在同一薄层板上展开，以保证Rf值的重现性3．分离参数

18.3平面色谱参数分离度（resolution；R）两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度（直径）的比值薄层色谱分离度示意图W1W2dFXdAB上式中，d

为两斑点中心间的距离，W1、W2分别为两斑点的宽度。分离度也可以用比移值来计算：

18.3平面色谱参数分离数SN（separationnumber）定义：相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0和Rf=1的两组分斑点间能容纳的斑点数。

SN是分离容量的主要参数经典薄板高效薄板

SN102018.5薄层色谱法按分离机制薄层色谱法可分为吸附、分配、离子交换和空间排阻色谱法等，这里主要讨论吸附薄层色谱法。按分离效能薄层色谱法又可分为经典薄层色谱法和高效薄层色谱法。

18.5薄层色谱法固定相、展开剂的选择

在吸附薄层色谱法中，选择固定相、展开剂的一般原则和吸附柱色谱法中的规则相似。

18.5.2固定相的选择

硅胶是应用最多的吸附剂，其粒度一般为10～40μm，适用于酸性和中性物质的分离。硅胶G——自含粘和剂（煅石膏）硅胶H——不含粘和剂，铺板时加入CMC-Na硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照下发荧光硅胶FH254+365——含荧光剂，254、365nm紫外光照下发荧光

碱性氧化铝

适于分析碱性、中性物质中性氧化铝适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝适于分析酸性、中性物质

18.5.3

展开剂的选择1、先用单一展开剂展开

若Rf值较大，加入适量极性小的溶剂；若Rf值较小，加入适量极性大的溶剂。

2、对难分离组分，可选用二元、三元甚至多元展开剂

3、对弱酸、弱碱组分，可加入一定比例的酸碱，防止斑点脱尾4、强极性溶剂，洗脱能力越强；弱极性溶剂，洗脱能力较弱。溶剂正己烷苯氯仿乙醇甲醇水极性小大

18.5.4操作方法2.实验技术

铺板→活化→点样→展开→定位(显色)→定性和定量1)制板多铺制粘合薄层板，均匀、表面光滑、厚度一致2)点样避免用水溶样（斑点扩散、不易挥发）,点样直径：2～4mm,点样工具：点样毛细管,定量：原点直径一致、点样间距精确；自动点样仪3)展开

展开前预饱和，防止边缘效应（同一板上，同一组分的斑点，位于边缘的点，Rf值大于中心的点）。展开大多采用上行法，也有下行法、径向法，双向展开、多次展开等方式。展开装置可分为立式、卧式和连续展开装置等。展开时最好恒温恒湿（温度和湿度影响Rf值和分离效果）18.5.4操作方法边缘效应的原因

展开剂蒸发速度从中央到边缘逐渐增加，边缘溶剂上升较中央快。在相同条件下，同一组分在边缘的迁移距离大于在中心的迁移距离。

18.5.5定性和定量分析(1)定位

首先在日光下观察，划出色斑，然后在波长为254nm或365nm的紫外灯下观察，以紫外吸收或荧光色斑定位。若用荧光薄板如硅胶HF，则以待测物质产生荧光猝灭的暗斑进行定位。既无色、又无紫外吸收的物质可采用显色剂显色定位。显色方法有喷雾显色和浸渍显色等，显色剂包括通用显色剂和专用显色剂。18.5.5定性和定量分析有机化合物的通用显色剂

①碘蒸气

浅黄色背景上，有机物吸附碘，产生棕色到黄色斑点，灵敏度达0.5～1μg。②10%硫酸乙醇溶液喷雾后105℃加热10～15min，日光或紫外光下观察，多数有机物显有色斑点18.5.5定性和定量分析通用显色剂①0.3%溴甲酚绿的80%甲醇液脂肪族羧酸：绿色背景上显黄色斑点②5%磷钼酸乙醇液喷雾后于120℃烘烤，还原物显兰色。③2%2，4—二硝基苯肼的乙醇液喷雾后于120℃加热3min，醛、酮显红色或橙色。④三氯化铁—铁氰化钾液检测酚类、芳香族胺类和甾族化合物。

18.5.5定性和定量分析(2)定性分析－－常用的方法是对照法①

利用斑点的Rf值定性②利用斑点显色特性定性③

利用斑点光谱特性定性④

利用薄层色谱与其他分析方法联用定性常用以下的定性分析方法18.5.5定性和定量分析定性方法—已知物对照法将样品与已知物对照品在同一薄层板上展开，比较组分与对照品的Rf值若两者Rf值不同，组分与对照品不是同一物经多种展开系统得到的Rf值与对照品一致，才可下肯定结论完全未知组分，单纯用TLC法定性困难

18.5.5定性和定量分析

直接定量法

薄层扫描法

定量法

洗脱法

将组分斑点自薄层上洗脱萃取，选适当方法测定。

目视法

斑点颜色深浅或面积随浓度变化（半定量）18.5.5定性和定量分析目视比较法一系列不同量的标准品点样展开显色样品

目视比较斑点颜色深浅、面积大小，求被测物含量近似值。半定量方法，精密度为±10%。各国药典中，原料药中杂质限量检查。18.5.6高效薄层色谱法简介高效薄层色谱（highperformancethinlayerchromatography；HPTLC）的分离效率比经典薄层色谱提高数倍

高效薄层板与经典薄层板的对比参数经典薄层板高效薄层板板尺寸（cm）20×2010×10,10×20颗粒度，平均（μm）205～15分布（μm）宽（10～60）窄层厚（μm）250～300200样品点加体积（μl）1～50.1～0.2原点直径（mm）3～6≤1分离斑点直径（mm）6～152～5展开距离（直线式，cm）10～153～6展开时间（min）30～2003～20检测限，吸收（ng）1～50.1～0.5荧光（ng）0.05～0.10.005～0.01每板分离样品个数1018～3618.5.6高效薄层色谱法简介

高效薄层板是由较小颗粒及颗粒均匀的吸附剂（或其他固定相）用喷雾法制备而成的薄层，一般为商品预制板，常有的有硅胶、氧化铝、纤维素和化学键合相薄层板等。薄层厚度为100－200μm，一般所用吸附剂颗粒直径为5μm和10μm。由于吸附剂颗粒小，流动相展开速度慢，易于达到平衡，传质阻抗小，组分均呈小而圆的斑点，使分离效果提高。18.5.7薄层扫描法简介基本原理测定薄层展开后斑点的透射光、反射光或荧光来测定物质的含量。18.5.7薄层扫描法简介透射法中斑点吸光度反射法中斑点吸光度

薄层扫描法分为透射法与反射法两种，薄层不均匀度及厚度对透射法测定有影响，基线噪声大，且玻璃对紫外光有吸收，所以反射法应用较普遍。反射法与透射法17.3.4薄层扫描法简介

18.5.7薄层扫描法简介

两束不同波长的光（λs：组分有峰值吸收称样品波长；λR：组分无吸收称参考波长）以一定频率（经斩光器）交替照射到薄层斑点上，测出其差值：特点：消除斑点处薄层均匀性影响，基线明显改善。

双波长薄层扫描仪光学系统示意图

L光源；MC单色器；CH斩光器；P薄层板PM光电检测器

基本原理17.3.4薄层扫描法简介

双波长扫描法中，选择组分斑点最大吸收峰的波长作为样品的测定波长λ1；选择斑点吸收光谱的基线部分作为参比波长λ2。记录的信号是λ1和λ2两波长处的吸光度之差，即扣除了斑点所在处的空白薄层吸收值，使薄层背景不均匀性得到补偿，扫描曲线的基线较平稳，提高了测定精度。扫描波长的选择18.5.7薄层扫描法简介

线形扫描

用一束比斑点略长的光束作斑点单向扫描。扫描曲线上的每一个峰相当于薄层上的一个斑点。特点：斑点形状不规则或浓度不均匀时，测量误差大，较适合于规则圆形斑点

18.5.7薄层扫描法简介

由于固定相颗粒的散射作用，光照射到薄层表面，除了产生透射光、反射光外，还产生散射光，造成偏离Beer定律。

浓度与吸光度之间的曲线为抛物线。KX0.0100.1200.2500.4000.6000.8001.00012吸光度A曲线校正法计算回归法（线性与非线性回归）。

曲线校正法是利用薄层扫描仪的线性补偿（linearer）功能，用电路系统将弯曲的曲线校正为直线。校正后，在一定的范围内，峰面积与斑点中物质的量（或点样量）成直线关系。18.5.7薄层扫描法简介曲线校正KX0.0100.1200.2500.4000.6000.8001.00012吸光度A图17-4线性校正

1.校正前的标准曲线

2.校正后的标准曲线

用一定波长的激发光束，扫描展开后的薄层，测定组分斑点在固定发射波长下的荧光强度。该法检测灵敏度高，专属性强，不需线性校正（因荧光波长大于激发波长，而散射光波长等于激发波长）。

凡化合物本身能发射荧光或经过化学反应能生成受紫外光激发而发荧光的化合物均适用薄层荧光扫描法。薄层荧光扫描法18.5.7薄层扫描法简介主要采用外标法在作出标准曲线，求得待测组分的线性范围后，可采用外标一点法或外标两点法。定量分析方法当工作曲线通过原点时，可采用外标一点法；当工作曲线不通过原点时，须采用外标两点法。18.5.7薄层扫描法简介定量分析—外标两点法配置两个浓度的标准溶液：Am1=a+bA1

（1）A1m2=a+bA2

（2）A样（1）-（2）得：A2

m2m样m1m