板蓝根中总生物碱含量测定方法的建立

板蓝根中总生物碱含量测定方法的建立

兰属植物的拉迪x是一个十字花科植物，具有清热解毒、凉血健脾、咽喉等功效。临床上主要用于热病、热毒入血液循环、热病初期或外部风热。有研究表明板蓝根中总生物碱是其抗病毒有效物质,目前板蓝根总生物碱的含量测定方法尚未见文献报道,本实验采用酸性染料比色法建立板蓝根总生物碱含量测定方法,并进行方法学考察,可以满足板蓝根总生物碱含量测定的需要。1仪器和试剂盒1.1仪器UV-2010型紫外可见分光光度计(日立公司)。1.2化学试剂的制备4-(3H)-喹唑啉(Sigma公司,批号:20100521),磷酸二氢钾(分析纯,天津科密欧,批号:20071126),溴麝香草酚蓝(分析纯,天津科密欧,批号:20041024),732离子交换树脂(国药集团化学试剂,批号:10024260),蒸馏水,其他试剂均为化学纯。2方法和结果2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液的制备精密称取4(3H)-喹唑啉对照品10.0mg,置100mL容量瓶中,1%盐酸乙醇溶液溶解并定容,摇匀,作为对照品溶液(每1mL含4(3H)-喹唑啉1mg)。2.1.2乙醇-乙醇法称取板蓝根最粗粉20g,加入一定量的80%乙醇水溶液,浸泡36h,装入渗漉筒中(3×10cm)。用15倍量80%乙醇水溶液渗漉提取,流速控制为1mL·min-1。收集渗漉液,回收溶剂至近干,用80%乙醇溶液溶解并定容至50mL容量瓶中,作为供试品溶液。2.2不同ph值缓冲溶液的制备2.2.1ph4。5醋酸-乙酸钠缓冲液的制备称取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8mL,溶解后再加水稀释至1000mL,即得。2.2.2ph值为ph5.0的磷酸缓冲液的制备取0.2mol·L-1磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至5.0,即得。2.2.3ph6。0乙酸-醋酸钠缓冲液的制备称取醋酸钠54.6g,加1moL·L-1醋酸溶液20mL,溶解后加水稀释至500mL,即得。2.2.4mol-1nahs法取0.2moL·L-1磷酸二氢钾溶液250mL,加0.2moL·L-1NaOH118mL,用水稀释至1000mL,即得。2.2.5naoh溶液称取磷酸二氢钾27.22g,加水使溶解成1000mL,取50mL加0.2moL·L-1NaOH溶液42.4mL,再加水稀释至200mL,即得。2.2.6溴氰胺和乙醇的制备精密称取溴麝香草酚兰0.0300g,溶于1moL·L-1NaOH溶液0.5mL中,加水稀释并定容至100mL容量瓶中。2.3氯甲烷的空白扫描分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1mL置分液漏斗中,加入5mL醋酸-醋酸钠缓冲液和5mL溴麝香草酚兰溶液,摇匀,用40mL三氯甲烷分4次萃取,每次10mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50mL容量瓶中。以三氯甲烷作空白扫描紫外全波长图谱(酸性染料缓冲液不做空白,因其在该波长处紫外吸收无干扰)。二者在417.5nm处均有最大吸收,故选择检测波长为417.5nm。2.4含量测定条件的个别因素研究2.4.1萃取溶剂的选择精密吸取0.5mL供试品溶液5份置分液漏斗,分别加入5mL2.2项下不同pH值为:4.76、5.20、6.10、6.75、7.62的缓冲液,再加入5mL0.03g·(100mL)-1溴麝香草酚兰溶液,摇匀,用40mL三氯甲烷分4次萃取,每次10mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50mL容量瓶中,以三氯甲烷作空白,于417.5nm处测吸光度。测得吸光度分别为:0.348、0.450、0.640、0.216、0.018。由此选择缓冲液pH值为:6.10。2.4.2溴碱香草酚兰溶液的配制精密吸取0.5mL供试品溶液5份置分液漏斗中,分别加入5mLpH6.0醋酸-醋酸钠缓冲液,再分别加入1、2、3、4、5、6mL0.03g·(100mL)-1溴麝香草酚兰溶液,其余操作同2.4.1项下。测的吸光度分别为:0.146、0.261、0.506、0.564、0.690、0.678。由此选择酸性染料用量为5mL。2.4.3溴碱香草酚兰溶液的配制精密吸取0.5mL供试品溶液5份至分液漏斗,分别加入3、4、5、6、7mLpH6.0醋酸-醋酸钠缓冲液,再分别加入5mL0.03g·(100mL)-1溴麝香草酚兰溶液,其余操作同2.4.1项下。测得吸光度分别为:0.716、0.735、0.752、0.736、0.727。由此选择缓冲液用量为5mL。2.4.4萃取次数的选择精密吸取0.5mL供试品溶液5份至分液漏斗,分别加入5mLpH6.0醋酸-醋酸钠缓冲液,再分别加入5mL0.03g·(100mL)-1溴麝香草酚兰溶液,摇匀,分别用三氯甲烷萃取1、2、3、4、5次,每次10mL。其余操作同2.4.1项下。测得吸光度分别为:0.465、0.592、0.678、0.691、0.696。由此选择三氯甲烷萃取4次,每次10mL。综上所述,选择pH6.0醋酸-醋酸钠缓冲液溶液,缓冲液用量为5mL,溴麝香草酚兰溶液用量为5mL,三氯甲烷萃取4次,每次10mL。2.5线性范围考察精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL对照品溶液,加5mLpH6.0醋酸-醋酸钠缓冲液,加入5mL0.03g·(100mL)-1溴麝香草酚兰溶液,摇匀,用三氯甲烷萃取4次,每次10mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50mL容量瓶中,以三氯甲烷作空白,于417.5nm处测吸光度,由实验结果得线性回归方程为:Y=0.023X+0.222,r=0.9999。说明4(3H)-喹唑啉在4～24μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。2.6精密度实验从同一批次供试品溶液中精密吸取0.5mL溶液6份,按2.4项下方法处理并测定吸光度,RSD=0.16%,表明仪器精密度良好。2.7加样回收测定精密称取板蓝根粉末6份,各1.0g,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,取供试品溶液0.5mL,置于分液漏斗中,按“2.4”项下方法操作,于417.5nm处依法测定吸光度,计算其平均含量为23.20%,RSD为0.14%。表明该方法重现性良好。2.8稳定性测定从供试品溶液中精密吸取0.5mL溶液,按2.4项下方法处理并测定吸光度,从第一次测A开始计时,分别测定0、15、30、45、60、90、120min后的吸光度,样品2h内颜色无明显变化,吸光度RSD=1.04%,表明供试品溶液在120min内具有良好的稳定性。2.9加样回收率和rsd从已知浓度的供试品中精取0.5mL溶液6份,分别加入0.2mL对照品溶液,按2.4项下方法处理并测定吸光度,计算加样回收率(n=6),平均回收率为100.3%,RSD=2.17%。3总原则从3批板蓝根中各取20g,按2.1.2项下方法制备供试品溶液,精密吸取0.5mL,按2.4项下方法测定总生物碱含量,每批次测3次取平均值,3批药材中总生物碱含量分别为:5.81%、5.79%、5.83%,RSD=0.34%。4总氧化物含量测定在实验过程中发现溴麝香酚蓝显色剂放置一段时间后会不稳定,因此显色剂应现用现配,从而保证测定结果的准确性。此外,严禁在三氯甲烷萃取液中混入水分,否则会使溶液变浑浊,影响比色结果。所以在测定吸光度前,必须用脱水剂(如无水硫酸钠)除去萃取溶剂中的水分。有研究表明板蓝根抗病毒物质基础是总生物碱,而2010版《中国药典