型钙通道抗剂mibefradil对动物能量代谢损伤的保护作用

型钙通道抗剂mibefradil对动物能量代谢损伤的保护作用

成熟的心肌有不同于成熟的结构和生理特征。它对再输血的反应具有独特的特点，如冷痉挛和收缩。如何有效减少未成熟心肌缺血再灌注损伤一直是小儿心脏外科的研究重点之一。缺血再灌注损伤的一个核心机制是钙离子超负荷。钙离子转运机制的不同包括肌浆网发育、Na+-Ca2+交换蛋白表达等是未成熟心肌与成熟心肌的主要区别之一。最近研究表明,在人、鼠等胚胎期和新生心肌中T型钙离子通道的表达明显高于L型钙离子通道的表达。随着心肌成熟,T型钙离子通道和L型钙离子通道的表达比例发生逆转,在成熟心肌中以L型钙离子通道表达为主,而T型钙离子通道的表达罕见。本文将特异性T型钙通道拮抗剂Mibefradil加入心脏停搏液中,观察其对未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用。1材料和方法1.1st.关于停采血液和sv组取2～3周龄新西兰大白兔32只,雌雄不拘,平均体重183±27g。根据不同停搏液组分实验分为4组,每组8只。ST组为St.Thomas停搏液;SV组为St.Thomas液中加入0.1μmol/LVerapamil;SM1组为StThomas液中加入0.1μmol/LMibefradil;SM2组为St.Thomas液中加入1μmol/LMibefradil。其中Mibefradil和Verapamil均为Sigma公司产品。1.2bxco心理分析断颈处死后开胸取心迅速在Radnoti离体心脏灌流装置(美国)上建立Langendorff模型,工作液为37℃、95%O2∶5%CO2Krebs-Henseleit液,主动脉逆灌注静水压70mmHg。经左心房置入左心室内充水球囊,连接压力传感器,接Buxco生理记录分析系统,调节左心室舒张末期压力为10mmHg左右,平衡30min。单次4℃上述4种不同成分的心脏停搏液停搏,维持局部心肌温度在15℃,停止灌注90min,37℃95%O2∶5%CO2Krebs-Henseleit液再灌注45min。1.3超声恢复lvesp、左心室扩张末压及最大压力变化速率dp分别于停灌注前、再灌注后20min和45min,使用Buxco生理记录分析系统(美国)记录并分析左心室收缩末压(leftventricularend-systolicpressure,LVESP)、左心室舒张末压(leftventricularend-diastolicpressure,LVEDP)以及最大压力变化速率(±dp/dt)。计算左心室发展压(developedpressure,DP,为LVESP与LVEDP之差)以及±dp/dt、DP恢复率。其中恢复率为再灌注后各项指标与基础值之比×100%。1.4a自动生物化学法检测心肌酶活性分别于停灌注前、再灌注后不同时段测量冠状动脉流量(coronaryflux,CF)。分别于停灌注前、再灌注后45min使用日立7170A自动生物化学分析仪测定冠状动脉流出液中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)浓度(IU/L)。于再灌注45min取心肌标本一部分,经消化加热烘烤,冷却和去离子水处理后,以岛津A680原子吸收分光光度计(日本)测定钙离子含量(mg/g组织干重)。于再灌注45min取心肌标本一部分,经组织匀浆后使用丙二醛测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定心肌组织丙二醛含量(μmol/g蛋白质)。1.5统计处理计量资料以x¯±sx¯±s表示,用SPSS11.5统计软件包对数据进行方差分析,P<0.05有统计学差异。2结果2.1功能、心肌酶学检测结果停灌注前幼兔体重、冠状动脉流量、心功能、心肌酶学等检测结果见表1(Table1)。可见上述各项指标各组间无统计学差异(P>0.05)。2.2不同时期冠状动脉流量的比较灌注前后冠状动脉流量见表2(Table2)。可见在整个缺血再灌注过程中,各组冠状动脉流量的差异无统计学意义(P>0.05)。2.3再次注入红细胞后的心率恢复缺血再灌注过程中测得的心功能各项指标见表3(Table3)。2.4然后将其与45分钟动脉出血和心肌其他指标进行比较再灌注45min冠状动脉流出液LDH含量、心肌丙二醛含量和心肌钙离子含量见表4(Table4)。3mibefradli在幼兔心肌缺血再灌注损伤中的作用T型钙离子通道于1985年首次在豚鼠中发现。与L型钙离子通道相比,T型钙通道激活、失活及到达峰值电流所需的膜电位较L型更低。T型钙通道可被选择性T型钙通道阻断剂米贝地尔(mibefradil)等阻断,也可被Ni2+阻断,而对能阻滞L型钙通道的有机和无机化合物则相对不敏感。另外,L型钙离子通道与T型钙离子通道对缺血的敏感性也不尽相同,L型对缺氧更敏感。在缺血损害初期,T型钙通道仍发挥作用,而L型钙通道已失活。提示就缺血保护而言,T型钙离子通道拮抗剂可能比L型钙离子通道拮抗剂更有效。在成熟心肌中T型钙通道与心脏起搏相关。研究表明,T型钙电流在新生大鼠中有表达,但在成年大鼠心室肌细胞不存在。除豚鼠以外,T型钙电流在成熟哺乳动物心肌细胞中罕见。这一点提示T型钙离子通道表达的改变可能是心肌成熟的标志之一,在心脏发育学上具有重要意义。另外,当压力超负荷引起心肌肥厚或心肌损伤后心肌细胞发生重构时,均有大量的T型钙离子通道基因的表达并导致T型钙电流的重新出现,提示T型钙离子通道与成熟心肌重构密切相关。本研究发现,与Verapamil相比,两种浓度的Mibefradil均明显提高幼兔心肌缺血再灌注后的心功能。再灌注45min时,DP和±dp/dt均有明显差异。与此对应的是Mibefradil较Verapamil明显减少了心肌缺血再灌注后LDH的释放和MDA的产生。说明在维持幼兔心功能和减轻幼兔心肌缺血再灌注损伤方面,Mibefradil明显优于Verapamil。Mibefradil缺血再灌注后心肌钙离子含量明显降低说明,减少心肌钙离子超负荷是Mibefradil有效保护缺血再灌注心肌的重要机制。同时各时段的冠状动脉流量没有明显差异,提示Mibefradil的心肌保护作用可能与冠状动脉血管内皮保护关系不大,这有待进一步证实。与单纯应用St.Thomas停搏液相比,两种浓度Mibefradil心功能各项指标没有明显差异。然而,较高浓度Mibefradil(1μmol/L)却明显减少了心肌缺血再灌注后LDH的释放和MDA的产生。1μmol/LMibefradil组的心肌钙离子浓度也明显低于单纯St.Thomas液组。说明加用Mibefradil能通过减少缺血再灌注后钙离子内流而达到保护幼兔心肌的作用。心功能上的无差异可能与本研究采取了低温停搏液保护下缺血有关,虽然有酶学改变,但器官整体功能没有明显变化。在今后的实验中拟延长缺血时间进一步研究。大量研究表明,未成熟心肌的兴奋—收缩藕联对细胞外钙离子浓度依赖很大,高浓度钙离子拮抗剂对未成熟心肌有更明显的抑制作用。在我们的研究中,两种浓度的Mibefradil在各检测指标上未发现明显差异。只是在缺血再灌注20min时,0.1μmol/LMibefradil组的+dp/dt恢复率明显高于Verapamil组,而1μmol/LMibefradil组与Verapamil组没有差异。有关Mibefradil对未成熟心肌缺血再灌注损伤保护的最佳浓度问题值得继续深入探讨。Verapamil虽然在成熟心肌缺血再灌注中具有明确保护效果,然而本研究发现了相反的结果:Verapamil组在心功能恢复上明显差于其他各组;冠状动脉流出液LDH浓度、心肌MDA浓度也明显较其他组高,表明Verapamil加重了缺血再灌注后未成熟心肌的心肌损害。Verapamil组心肌钙离子浓度也是均明显高于其他各组,提示Verapamil不仅没有减少未成熟心肌缺血再灌注后钙离子内流,反而增加了钙离子内流,从而加重心肌损伤。有研究表明其他种类L型钙离子通道拮抗剂硝苯吡啶、尼卡地平等对缺血再灌注的未成熟心肌具有保护作用,分析原因可能是硝苯吡啶、尼卡地平主要作用于血管,而对心脏的作用相对很弱,其心肌保护作用机制在于冠状动脉扩张和血管内皮保护。而同样具有较强心脏作用的L型钙离子拮抗剂地尔硫卓也有损伤未成熟心肌