桂枝甘草汤及其提取物组分抗心律失常作用的实验研究

桂枝甘草汤及其提取物组分抗心律失常作用的实验研究

桂枝甘草汤是温阳心阳的基础。汉代张仲景的《伤寒论脉证结合治疗》一文写道：“出汗过多，别人的手冒着心脏，感到心悸和割伤。主要是桂枝甘草汤。”。现代临床多以本方为基础方治疗“心悸”等相关病证。更有不少临床报道表明,本方对不同类型心律失常均具有较好的疗效。本研究从多种心律失常动物模型研究入手,应用现代工艺对桂枝甘草汤提取分离,通过动物实验确定桂枝甘草汤抗心律失常的作用机理及其相应的活性组分。1实验材料1.1电子分析天平MedLab多道生物信号分析系统(南京美易科技有限公司);电子分析天平(德国artorius);DDB型微量蠕动泵(上海之信仪器有限公司)。1.2实验动物及设备Wistar大鼠,140只,雌雄各半,体重200～220g,豚鼠64只,雌雄各半,280～300g,均由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。1.3桂枝甘草汤及其它组分水合氯醛,氯化钡,氨基甲酸乙酯(中国医药集团上海化学试剂公司);桂枝甘草汤及各组分(自制);硫酸奎尼丁(批号040902,上海信谊嘉华药业有限公司);乌头碱(纯度>95.5%,上海同田生化技术有限公司);哇巴因(纯度>95.5%,sigma公司)。2实验方法2.1药物的制备和组成2.1.1桂枝甘草汤、甘草汤组的制备桂枝甘草汤各个组分的制备:桂枝、甘草按2:1的比例加10倍量水,用水蒸汽蒸馏法提取挥发油,药渣加10倍量水煎煮30min,煎液合并,加热浓缩成膏状,上AB-8x型大孔树脂柱,以蒸馏水、30%乙醇、60%乙醇洗脱,分别得到桂枝甘草汤水组分、桂枝甘草汤30%、60%乙醇组分,各组分均定容至1.26g·ml-1生药量浓度,低温储存备用。桂枝甘草汤的制备:桂枝、甘草按2:1的比例加10倍量水,浸泡30min,沸腾20min,滤出药液,再加10倍量水煎煮20min滤出药液。合并2次药液,低温蒸发浓缩至1.26g·ml-1生药量浓度,低温储存备用。2.1.2制备桂枝甘草汤模型①桂枝甘草汤提取物水组分组(简称水组分);②桂枝甘草汤提取物30醇组(简称30醇组);③桂枝甘草汤提取物60醇组(简称60醇组);④桂枝甘草汤全方组(简称全方组);⑤桂枝甘草汤挥发油组(简称挥发油组);⑥模型组;⑦阳性药(硫酸奎尼丁)对照组。2.2心律失常事件Wistar大鼠,70只,雌雄各半,随机分成七组,每组10只。给药量:桂枝甘草汤及其各提取物组分给药量相当于6.48g·kg-1生药量;模型组给予等体积蒸馏水,阳性对照组按15mg·kg-1给药。实验前进行预防给药,给药后1h进行实验。用10%水合氯醛(300mg·kg-1)将大鼠腹腔麻醉,记录正常II导联心电图,弃去心电不正常的大鼠,舌下静脉注射0.4%BaCl2(4mg·kg-1),4s内注入完毕,分别记录心律失常发生率、出现时间及持续时间。发生率用Fisher确切概率法检验,出现时间及持续时间用t检验统计显著性。2.3乌苏叶、管理、实验Wistar大鼠,70只,雌雄各半,随机分成七组,每组10只。给药量:桂枝甘草汤及其各提取物组分别给予药量相当于6.48g·kg-1的生药量;模型组给予等体积蒸馏水,阳性对照组按15mg·kg-1给药。乌头碱的配制:以0.1mol·L-1HCl溶解,生理盐水稀释,以1mol·L-1NaOH调pH至6,生理盐水定容(8μg·ml-1),冰箱保存,3天内有效。实验前进行预防给药,每天1次,连续5d,第5d给药1h后进行实验。取大鼠,用25%乌拉坦(6ml·kg-1)腹腔注射麻醉,然后将大鼠背位固定在手术台上。启动Medlab生物信号采集处理系统,连接II导联心电图,用恒速蠕动泵由舌下静脉以2μg·min-1的恒速注入乌头碱溶液,分别观察和记录II导联心电图及引起室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)、心脏停搏(CA)时所用的时间,换算成乌头碱的等效阈剂量,并进行t检验。2.4mg甲基-1给药豚鼠56只,随机分成七组,每组8只。给药量:桂枝甘草汤及其各提取物组分别给予药量相当于5.58g·kg-1生药量;模型组给予等体积蒸馏水,阳性对照组按30mg·kg-1给药。实验前进行预防给药,每天1次,连续5天,第5天给药后1h进行实验。取鼠,用乌拉坦(1.2g·kg-1)麻醉,仰位固定,四肢皮下插入针状电极,以Medlab生物信号记录分析系统连续监视并记录ECG,颈外静脉插管,动物心电稳定后,经颈外静脉以3μg·min-1速度给予哇巴因,记录ECG,分别观察和记录II导联心电图及引起室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)、心脏停搏(CA)所用的时间并换算成哇巴因的等效阈剂量,进行t检验。3结果3.1组患者发生情况对比如表1所示:①30醇组、全方组、阳性药组,均可明显抑制氯化钡诱发大鼠心律失常的发生,与模型组比较,P<0.05;②水组分、阳性药对照组、30醇组可明显延迟氯化钡诱发大鼠心律失常的出现时间(P<0.01或P<0.05);③水组分、30醇组、阳性药对照组、全方组可明显缩短氯化钡诱发大鼠心律失常的持续时间(P<0.01)。3.2不同给药剂量对乌苏烷室性早博弈、室性心动过速、心脏停索的影响模型组在恒速iv乌头碱数分钟后即可出现室性早搏,渐有二联律、三联律出现,进而形成连续的室性心动过速,发展为心室纤颤直至心脏停搏。如表2所示:30醇组、水组分、全方组、阳性药组可明显增加乌头碱诱发致大鼠发生室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室纤颤(VF)、心脏停搏(CA)的乌头碱阈剂量(P<0.01或P<0.05);60醇组、挥发油组作用不明显(P>0.05)。3.3苏氏原螯虾对心动过速的影响模型组在恒速iv哇巴因数分钟后即可出现室性早搏,渐有二联律、三联律出现,进而形成连续的室性心动过速,发展为心室纤颤直至心脏停搏。如表3所示:水组分、30醇组、全方组、阳性药组可明显增加哇巴因致豚鼠发生室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室纤颤(VF)、心脏停搏(CA)的哇巴因阈剂量(P<0.01或P<0.05);60醇组、挥发油组作用不明显(P>0.05)。4迟心律失常事件我们通过实验发现桂枝甘草汤及其提取物30醇组分、水组分能够不同程度地阻止氯化钡所诱发的心律失常,推迟心律失常的发生时