瑞香狼毒总黄酮提取物抗肿瘤作用的研究

瑞香狼毒总黄酮提取物抗肿瘤作用的研究

狼毒是瑞香科的一种狼毒植物。这是三种常用的中药“狼毒”之一。肿瘤活性显著。近年来，东北和河北的人们对胃癌、肠癌和肺癌进行了有效的治疗效果。有关瑞香狼毒抗肿瘤活性及其机制研究,本研究小组已做了10多年的基础研究工作,对瑞香狼毒水提物、醇提物的抗肿瘤作用、血清药理学及分子生物学机理做了较全面细致的工作。为了研究瑞香狼毒中的抗肿瘤活性成分,作者对瑞香狼毒中的总黄酮成分进行了提取和含量测定,通过体外细胞培养实验和小鼠移植性肿瘤评价瑞香狼毒中总黄酮提取物的抗肿瘤效果。1材料表面1.1特芬材料瑞香狼毒由兰州市药材供应站提供,经西北师范大学植物所晏民生副教授鉴定为瑞香科植物瑞香狼毒。1.2动物Balb/c纯种小鼠,体重18～22g,雌雄兼有,SPF级,由兰州军区总医院动物实验科提供并负责饲养。1.3ma公司的试剂RPMI-1640培养基为Gibco公司的产品;MTT为Sigma公司的产品;小牛血清为四季青公司的产品;试剂均为分析纯;环磷酰胺(CTX),上海华联制药有限公司生产,批号031015;长春新碱(VCR),上海华联制药有限公司生产,批号031102A。1.4细胞库细胞库人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402和人白血病细胞HL-60均引自中国科学院上海细胞生物研究所的细胞库;用RPMI-1640培养液(含10%的小牛血清,100kU·L-1青霉素,100mg·L-1链霉素),37℃,5%CO2,相对湿度100%培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。1.5小鼠接种传代S180实体瘤由甘肃省肿瘤所引进,本实验室冷冻保存,用Balb/c小鼠接种传代;H22实体瘤由兰州大学生命科学学院引进,本实验室冷冻保存,用Balb/c小鼠接种传代。2方法2.1聚酰胺树脂设计方案瑞香狼毒95%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后,装入玻璃管柱中,用石油醚流洗,去除其中的叶绿素和极性较小的成分;流洗结束后倒出硅藻土化合物,挥干溶剂,重新装入玻璃管柱,用正丁醇流洗提取,用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物在滤纸上显色后在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检识监控,提取至流洗液无黄酮反应时结束;正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂,用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱,依次用水和95%的乙醇洗脱,收集95%的乙醇洗脱液,洗脱至检识无黄酮反应时结束;浓缩95%的乙醇洗脱液,自然干燥,挥干溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。2.2回用溶液参考文献的方法进行测定。精密称取40mg总黄酮提取物样品,用60%乙醇溶解定容于100mL量瓶中,摇匀。精密量取25mL置于50mL量瓶中,加水稀释至刻度(0.2mg·mL-1)。精密量取上述溶液3.0,4.0,5.0mL置于10mL量瓶中,再分别稀释至相当样品浓度。按照标准曲线的测定方法测定吸收度后,计算样品中总黄酮的含量。2.3mtt比色法参考文献的方法进行。2.4收集和形成法参考文献的方法进行。2.5小鼠急性毒性试验取60只Balb/c纯种小鼠,体重18～22g,雌雄各半,随机分成6组,腹腔注射给药,每只0.6mL,给药剂量分别为4.00,3.00,2.25,1.69,1.27,0.95g·kg-1,给药后连续观察14d,记录小鼠死亡只数。2.6给药剂量的确定参考文献的方法进行。瑞香狼毒总黄酮提取物用山梨醇甲酯研磨配制成0.025,0.05,0.10g·kg-13个给药剂量组,分别编号为ScL.F1,ScL.-F2,ScL.F3;对照组腹腔注射等量的山梨醇甲酯,阳性对照组给CTX0.02g·kg-1。2.7统计分析各组数据使用SPSS10.0统计软件分析,组间样本比较采用t检验。3剂量选择及其抑制作用3.1瑞香狼毒总黄酮提取物中黄酮含量测定以芦丁为标准对照品绘制标准曲线,得标准曲线方程:A=11.669C-0.007,r=0.9996。A代表各含量样品吸收度,C代表不同芦丁提取物浓度。测定结果见表1,瑞香狼毒原药材中黄酮含量为1.13%,总黄酮提取物中黄酮含量为24.37%。3.2瑞香狼毒总黄酮提取物对体外培养的肿瘤细胞增殖的抑制作用MTT法检测结果表明,瑞香狼毒总黄酮提取物与长春新碱对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901和人肝癌细胞BEL-7402增殖都表现出较强的抑制作用,呈现较好的剂量依赖性抑制作用。同时,瑞香狼毒总黄酮提取物的对以上2株细胞的抑制作用略强于长春新碱;对体外培养的人白血病细胞HL-60的增殖有一定的抑制作用,但略弱于长春新碱;线性回归法计算IC50值,结果见表2。集落形成法检测结果表明:瑞香狼毒总黄酮提取物对以上3株细胞的克隆增殖均有抑制作用,但效果低于长春新碱;线性回归法计算IC50值,结果见表2。3.3瑞香狼毒总黄酮提取物急性毒性作用实验数据经由蓝宙药学专业软件系列之LD50数据处理程序计算得半数致死量LD50=1.9848g·kg-1,说明瑞香狼毒总黄酮提取物的急性毒性小。3.4瑞香狼毒总黄酮提取物对小鼠移植性肿瘤H22生长及脾脏指数的影响瑞香狼毒总黄酮提取物对小鼠移植性肿瘤H22的生长有显著的抑制作用,并和剂量正相关。ScL.F2,ScL.F3组对肿瘤抑制率与对照组相比有显著性差异(P<0.05),但低于阳性对照组CTX。各剂量组小鼠的体重无明显的下降,说明在给药剂量范围内瑞香狼毒总黄酮提取物的毒性很小。各组对荷瘤S180小鼠的脾脏指数的影响很小,无显著性差异(P>0.05)。3.5瑞香狼毒总黄酮提取物对小鼠移植性肿瘤S180生长及脾脏指数的影响瑞香狼毒总黄酮提取物对小鼠移植性肿瘤S180的生长有显著的抑制作用,并和剂量正相关。ScL.F2,ScL.F3组对肿瘤抑制率与对照组相比有极显著性差异(P<0.01),而且ScL.F3组的抑制率高于阳性对照组CTX。ScL.F2组使荷瘤S180小鼠的脾脏指数降低,有显著性差异(P<0.05)。其余各组均对小鼠的脾脏指数的影响很小,无显著性差异(P>0.05)。4mtt法检测总黄酮提取物的体外毒活性寻找具有抗癌作用强、抗癌谱广、副作用小的天然活性化合物是抗癌药物研究的重要途径。近年来对瑞香狼毒大量的药理研究表明,瑞香狼毒具有很强的抗肿瘤作用,并作为抗癌中药试用于临床。冯威健等从瑞香狼毒中分离得到抗肿瘤活性很强的二萜类化合物尼地吗啉,并认为尼地吗啉是瑞香狼毒中的主要抗肿瘤活性成分,但其活性剂量与毒性剂量接近,其很强的毒性作用降低了临床应用的价值。目前,对瑞香狼毒大量的化学成分研究表明,瑞香狼毒中还含有结构比较特殊的双二氢黄酮类、木脂素类、香豆素类等化合物,而这些成分对于抗肿瘤活性化合物的筛选具有广阔的研究开发前景。本研究结果表明,通过MTT法检测瑞香狼毒总黄酮提取物的体外抗肿瘤作用,其活性高于临床常用的植物来源的抗肿瘤药物长春新碱;但集落形成法检测结果表明,其对肿瘤细胞的克隆增殖抑制活性远低于长春新碱。其原因可能为总黄酮提取物对肿瘤细胞的细胞毒作用较强,对肿瘤细胞分裂增殖的抑制作用较弱。动物实验检测其LD50=1.9848g·kg-1,急性毒性较小;并且对小鼠移植性肿瘤S180和H22的生长有显著的抑制作用,和剂量呈正相关。高剂量组(0.1g·kg-1)对小鼠移植性肿瘤S180和H22的抑制率分别为45.64%,47.59%,与阳