下边缘皮质网络降解后对吗啡cpp复燃的影响

下边缘皮质网络降解后对吗啡cpp复燃的影响

药物中毒是一种慢性的高复发性脑疾病。反复使用成瘾药物之后,可以在成瘾药物产生的奖赏效应和中性的用药环境之间产生一种强烈的关联性记忆。研究表明,这种强烈的记忆能够持续很长时间甚至终生。药物本身、药物相关线索或者应激的再次出现都可以激活药物相关记忆,引起成瘾者对于药物的强烈渴求。无论是正常的记忆还是异常的记忆都有着相同的动态过程。当新的信息经过一个蛋白质合成依赖的过程逐渐稳定下来,称为记忆的巩固。如果只出现中性刺激而没有药物的奖赏效应,记忆又会处于一个不稳定的阶段。在这个过程中,记忆可能发生两个不同的过程,再巩固或者消退。消退记忆被认为是一种新的学习记忆过程,只能抑制原有记忆的表达而对原有的记忆印迹并不能够抹除。研究报道增强消退记忆可以用来预防复吸,但相关的神经机制还不清楚。消退记忆和其他形式的学习记忆的神经生物学过程一样,也包括获得、巩固、唤起/表达阶段。目前对于恐惧记忆和成瘾记忆的消退机制已开展了大量研究,发现多种转录因子、神经递质受体以及细胞内信号分子在消退中起作用。同时发现内侧前额叶皮层(mPFC)、杏仁核(Amy)、海马(Hip)这三个关键的脑区及其投射环路,介导了消退记忆。但关于细胞外基质(ECM)是否参与消退记忆及之后低剂量药物引起的觅药行为的复现目前还没有相关研究报道。细胞外基质在哺乳动物所有的组织中都存在,但其在不同的组织中组成成分不同。在中枢神经系统中,GABA能的中间神经元及一些锥体神经元周围,细胞外基质形成特殊的致密样结构,被称为神经元周围基质网络PNNs。PNNs中发挥功能的主要是硫酸软骨素蛋白聚糖CSPGs中的葡胺聚糖链GAGs。硫酸软骨素酶ChABC可以将CSPGs中的GAGs降解下来,从而破坏PNNs的结构和功能。研究表明,PNNs在细胞迁移、细胞成熟和分化以及组织内稳态当中均发挥重要作用。此外,PNNs在神经可塑性和学习记忆当中的作用逐渐被科学家所重视。但是,PNNs及其功能蛋白CSPGs是否参与并调节了吗啡奖赏记忆的消退过程和复吸行为目前还不清楚。因此,本实验采用CPP模型,以下边缘皮质IL-mPFC为目标脑区,硫酸软骨素酶ChABC作为工具酶,研究PNNs结构在吗啡奖赏消退记忆及复燃中的作用,并进一步探讨其在治疗药物成瘾复吸中的作用。1材料和方法1.1动物、动物及大鼠的生长Sprague-Dawley(SD)大鼠,♂,购自北京大学医学部实验动物中心,许可证编号:SCXK(京)2006-2008,体重220-240g。动物房恒温、恒湿(温度23℃±s2℃,湿度50%±s5%),采用12h昼夜节律控制(8:00-20:00)。实验开始前,动物在动物房适应5-7d,自由饮水,进食。开始实验时,大鼠重300-320g。大鼠接受的所有操作均符合实验动物伦理学,遵循国家和北京大学医学部动物使用和保护委员会颁布的条例。1.2为特殊的回血单胞菌主要产物2盐酸吗啡,购自青海制药厂,批号:20040401。吗啡溶于生理盐水,浓度为10mg·ml-1,每只动物按照1ml·kg-1皮下给予吗啡或生理盐水。ChondroitinaseABC,溶于0.1MPBS,浓度为0.02U·μl-1。核团微注射给药时,将与微量注射器相连的针头插入头上埋好的管内,固定。以0.5μl·min-1的速度,推药1min,并停留1min。将其从大鼠头上取下,并盖好套管的帽。1.3目标脑区坐标的测定大鼠经50%戊巴比妥钠(腹腔给药)麻醉后,将大鼠放到脑立体定位仪上,(俯卧位),用耳棒在水平方向固定好大鼠。将大鼠头顶颅骨结缔组织刮干净,并用止血弯夹暴露颅骨。用电钻钻3个孔,拧紧螺丝。记录前囟点的数值后,计算目标脑区坐标,移动套管臂将套管埋入目标脑区上方1mm处。IL-mPFC的坐标参考本实验室之前的研究:AP,+2.9mm;ML,±1.0mm;DV,-4.8mm(见图1)。套管偏离中心线角度调整为6度以避开侧脑室。套管经不锈钢螺丝和牙科水泥固定于颅骨上,待水泥干燥后即可将大鼠取下。手术后注射青霉素以防止感染,单笼饲养,休息7d。1.4cpp行为实验1.4.1自然偏好大鼠dp实验均采用无偏设计。训练方法参考本实验室的既往研究。基础值测试(d1):将大鼠由中间箱放入,任其在三箱中自由活动15min,由电脑记录其在各箱中的停留时间。大部分大鼠在各箱停留时间没有明显差异,约占总时间的1/3,少数大鼠表现出明显的自然偏爱,这部分大鼠被剔除出本实验(在任一箱的停留时间大于540s)。CPP训练(d2-9):大鼠每天接受吗啡或生理盐水皮下注射(s.c.)后放入相应的箱中45min,其中d2、4、6和d8接受吗啡给药(10mg·kg-1,s.c.);d3、5、7和d9接受生理盐水(1ml·kg-1,s.c.)。训练结束后,将大鼠放回饲养笼。CPP获得测试(d10):方法同基础值测试。1.4.2复燃测试方法cpp大鼠在药物干预后d3(d14)到d10(d21)进行CPP消退训练,共持续8d。大鼠d14、16、18、20给予生理盐水(1ml·kg-1,s.c.)并放入伴药箱45min;d15、17、19、21也给予生理盐水(1ml·kg-1,s.c.)并放入非伴药箱45min。结束之后大鼠放回饲养笼。d22进行测试,如果大鼠表现已没有显著的偏爱,在测试后d1(d23)进行CPP复燃实验。给予低剂量吗啡(3mg·kg-1,s.c.)后进行CPP测试,方法同基础值测试。1.5吗cpp复燃实验1.5.1下边缘皮质神经元周围基质网络PNNs降解在吗啡消退记忆及复燃中的作用为了检测下边缘皮质中的神经元周围基质网络PNNs结构在吗啡线索记忆消退及复燃过程中的作用,我们首先将大鼠进行8d的吗啡CPP训练,然后进行CPP测试。测试后的d1将大鼠随机分为两组,一组于目标脑区微注射ChABC(n=10),另一组微注射相应的溶媒(n=9)。药物干预后两组大鼠均开始进行持续8d的消退训练,CPP测试大鼠表现已没有显著的偏爱,测试后d1给予低剂量吗啡进行CPP复燃实验,观察下边缘皮质PNNs降解对于吗啡CPP复燃的影响(见图2A)。1.5.2下边缘皮质神经元周围基质网络PNNs降解在吗啡CPP获得中的作用为了进一步确定下边缘皮质神经元周围基质网络PNNs在新的学习记忆当中的作用,实验d1我们将大鼠分为两组。一组大鼠于IL-mPFC脑区微注射ChABC(n=10),另一组大鼠微注射相应的溶媒(n=9)。药物干预后d3进行CPP基础值测试,测试后的d1开始吗啡CPP训练。因为吗啡的剂量是10mg·kg-1,为了避免“天花板”效应,我们只进行2d的训练。然后进行CPP测试,观察下边缘皮质PNNs降解对于吗啡CPP获得的影响(见图3A)。1.6分析方法即检测方案设计CPP值采用伴药箱时间与非伴药箱时间的差值表示,结果以平均值±SEM表示。采用重复测量的双因素方差分析。P<0.05被认为有统计学意义。2结果2.1药物和测试时间对CPP取得的行为学数据采用重复测量的双因素方差检验分析,以干预药物(ChABC和PBS对照)作为组间因素;以不同测试时间(基线测试、训练后测试、消退后测试和复燃测试)作为组内因素。分析结果显示,测试时间对吗啡CPP值有显著影响(F(3,48)=21.28,P<0.001),且干预药物和测试时间(F(3,48)=3.81,P=0.016)存在显著的交互作用。Post-hoc分析表明:经过吗啡CPP训练后,实验组(ChABC)大鼠和对照组(PBS)大鼠均获得了显著的条件性位置偏爱,且经过消退训练后均达到了CPP消退的标准,两组之间没有显著的统计学差异(P>0.05)。与对照组相比,实验组大鼠消退训练后,低剂量(3mg·kg-1,s.c.)吗啡点燃的CPP值显著降低(P<0.001)(见图2B)。这些结果表明,在吗啡CPP训练后下边缘皮质给予ChABC将神经元周围基质网络PNNs降解之后,能够抑制消退训练后低剂量吗啡引起的觅药行为的复现。2.2测试阶段:测试时间和干预药物对治疗连接的影响对CPP获得的行为学数据采用双因素方差检验分析,以干预药物(ChABC和PBS对照)作为组间因素;以不同测试时间(基线测试和训练后测试)作为组内因素。分析结果显示,测试时间对吗啡CPP值有显著影响(F(1,14)=5.58,P=0.033),而干预药物以及干预药物和测试时间的交互作用均无显著作用(F(1,14)=0.04,P=0.85)。Post-hoc分析表明:经过吗啡CPP训练后,实验组(ChABC)大鼠和对照组(PBS)大鼠均获得了条件性位置偏爱,两组之间没有显著的统计学差异(P>0.05)(见图3B)。这些结果表明,下边缘皮质给予ChABC将神经元周围基质网络PNNs降解之后,对于吗啡CPP的获得没有影响。3下边缘皮质pnns降解对恐惧记忆的调节作用本课题研究了下边缘皮质IL-mPFC脑区内PNNs联合消退训练对吗啡奖赏记忆的作用。结果发现:(1)消退训练前在IL-mPFC内微注射ChABC将PNNs降解之后,能够抑制低剂量药物引起的觅药行为的复现;(2)吗啡CPP训练之前在IL-mPFC内微注射ChABC,对于奖赏记忆的获得没有影响。消退训练是一种新的抑制性关联性学习,抑制原有记忆的表达。以往研究发现,内侧前额叶皮层的一个亚区,下边缘皮质,对于消退过程中的抑制性关联性学习有重要的调节作用。其他研究还发现消退记忆需要IL内NMDA受体,CB1受体,β肾上腺素受体和代谢型谷氨酸受体mGluR5的激活。在我们的实验中发现消退训练前将下边缘皮质中的PNNs降解之后,能够抑制吗啡CPP的复燃。可能的原因有两个,一个是PNNs降解破坏了原有奖赏记忆的储存,或者该干预方法促进了消退记忆的学习过程,最终阻止觅药行为的复现。最近的一个关于恐惧记忆的研究表明,内侧前额叶皮层mPFC的两个亚区下边缘皮质IL和边缘前皮质PL具有不同的神经投射和功能,对于记忆的调节作用可能是相反的。PL调节恐惧记忆的表达而IL参与恐惧记忆的消退过程,提示IL在消退的抑制性关联性学习中发挥重要作用。我们在研究中观察到的行为学现象,可能是由于PNNs降解之后,促进了消退记忆的学习过程而并不影响原有记忆。为了进一步说明这个问题,我们又观察了下边缘皮质PNNs降解对于吗啡CPP获得的影响。为了防止“天花板”效应,我们在实验中只进行了两天的吗啡CPP训练。得到的结果与之前的研究一致,下边缘皮质PNNs降解并不影响吗啡CPP的获得。PNNs分布于特殊的神经元周围,调节结构可塑性和突触可塑性。对于PNNs的研究最初集中于中枢神经系统损伤,尤其是脊髓损伤的研究。脊髓损伤之后,在损伤部位会形成纤维瘢痕,抑制其结构和功能的恢复。其中起主要抑制作用的是PNNs中的CSPGs。研究表明,如果在损伤部位用ChABC将PNNs降解之后,会促进轴突再生和功能恢复。个体在发育过程中会经历一个可塑性非常强的时期,称为关键期(criticalperiod)。Pizzorusso等人在2002年的研究发现,大鼠视皮层眼优势可塑性的关闭与视皮层PNNs的形成有关。如果在可塑性已关闭的成年大鼠视皮层,用ChABC将PNNs降解之后,这种可塑性又会被重新激活。动物在经过单眼剥夺的操作之后会出现眼优势柱的转移。近来研究表明PNNs在学习记忆当中也发挥重要作用。成年小鼠杏仁核内PNNs被降解之后,形成的恐惧记忆与幼年小鼠形成的恐惧记忆一致,易于被消退训练抹除。如果在恐惧记忆形成之后再给予ChABC则没有这种作用,说明ChABC的这种调节作用是特异性的。而且这种作用并不是由于异体蛋白注射诱发的局部炎症反应造成的,因为之前有研究发现注射ChABC不会在注射脑区诱发显著的炎症反应,也不会对注射脑区的神经元和胶质细胞的存活产生影响。同时用免疫组化的方法证明,ChABC能够降解PNNs。关于恐惧记忆的研究表明,药理学干预联合行为学方法的治疗作用更加明显。我们的研究结果发现,下边缘皮质PNNs降解联合消退训练能够抑制消退后低剂量吗啡引起的CPP复燃,这种作用可能是通过增强吗啡CPP的消退训练的效果来达到的。PNNs降解在吗啡奖赏消退记忆中的作用机制目前还不明确。可能涉及到的是突触可塑性或者GABA能的抑制性神经传递。CSPGs对于轴突生长及突触的形成具有抑制作用。CSPGs降解之后可以重新激活神经可塑性,使恐惧记忆在消退过程中被抹除。因此,我们认为PNNs降解可能通过增强突触可塑性,在消退训练过程中形成更多的