儿童脓疱疮溶血性链球菌的分离及其抗菌药物敏感性研究

儿童脓疱疮溶血性链球菌的分离及其抗菌药物敏感性研究

脓疱是儿童常见的感染性疾病。主要病原体为金色霉（sa）和a组溶血性球菌。答：唾液腺炎和答：溶血性球菌是引起儿童皮肤感染的重要病原体。除了引起喉咙炎、嗜水性热和败血症等非侵行性疾病外，一些情况下还可能导致致命的肌肉感染和致命休克综合征，如致命性肌腱炎和致命的减热综合征。gas后延迟性gas感染后的非感染性疾病，如急性风湿热和球形尿道感染后的尿失禁。青霉素是治疗GAS感染的首选药物,对青霉素过敏的患者亦可选用大环内酯类抗生素。近年来关于该菌对大环内酯类抗生素耐药的报道较多,国内已经报道了该菌对大环内酯类抗生素的高耐药率,但由A组β溶血性链球菌引起的皮肤感染资料较为有限,为此,本文对北京儿童医院皮肤科2003—2008年的脓疱疮患儿分离出的GAS进行了耐药及emm分型研究。1数据和方法1.1病例选择及资料收集选取2003-2008年北京儿童医院门诊就诊的脓疱疮患儿1735例,自皮损部位分离GAS共计52株,入选病例详细记录性别、年龄、就诊日期、皮损初发部位、取材部位、皮损诱发因素、合并症等。1.2杆菌肽检测菌株抗血清分型将皮肤脓液标本接种于5%羊血培养基,挑选B溶血菌落进行杆菌肽检测,阳性株采用Lancefield族特异性抗血清分型以确定是否为GAS。1.3实验数据的采集用琼脂稀释法对52株GAS进行最小抑菌浓度(MIC)测定,抗菌药物种类包括青霉素、头孢拉啶、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、四环素和氧氟沙星,均购自中国药品生物制品检定所。以质控菌株肺炎链球菌ATCCA49619作为琼脂稀释法药敏试验质控菌株,在每次试验前均做质控对照,当其MIC值在美国临床实验室国家标准委员会规定的范围内,可以使用本次实验数据进行分析。抗生素敏感实验结果判定根据CLSI,收集的菌株经过2次转种,血平皿上孵育18~24h的新鲜GAS菌株中挑取适量菌落至生理盐水中,制成悬液调至0.5麦氏浊度单位,多点接种器蘸取0.5麦氏浊度单位的GAS悬浊液1~2mL接种于5%羊血的MH培养基上(Mueller-Hinto琼脂+5%羊血的培养基)。1.4药基因扩增引物大环内酯类抗生素耐药基因检测提取52株GAS的DNA,用PCR方法对大环内酯类抗生素耐药基因ermB、ermA、mefA,进行扩增,所用引物见表1。PCR条件:94℃预变性1min后,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环后72℃再延伸10min。PCR扩增产物1.0%~1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色成像。1.5as-to1.5.1gas蛋白n末端的pcr扩增emm基因的扩增采用根据emm基因5’端碱基组成特点研究出来的引物:(F)TATTGGCTTAGAAAATTAA(R)GCAAGTTGTTCAGCTTGTTT对GAS的M蛋白N末端进行PCR扩增。PCR反应:50反应体系中含有200pmol/L,dNTP浓度为20μmol/L的引物l、2各1μL,2UTaq酶,25μgDNA模板,30个循环:94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1.5min,最后1循环72℃引物延伸5min。1.5.2pcr产物的测量序列以测序引物TATTGGCTTAGAAATTAAAAACAGG为引物直接测序。委托华大基因生物技术有限公司进行操作。1.5.3序列与gebak中序列的同源性序列分析通过用blast软件分析所测序列与GenBank中序列的同源性,以判断emm基因分型的结果,根据DNA序列同源性≥95%判为同一基因型的标准。1.6耐药率及emm分型分布的比较用SPSS11.5软件进行数据处理。耐药率及emm分型分布比较采用四格表χ2检验及Fisher精确比较,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1炎性毒性感染本文收集的52例患儿有1例资料缺失,其余51例,年龄1~8岁,中位年龄4岁。51例中,男35例(68.6%),女16例(31.3%)。脓疱疮发生与季节相关,高峰时间出现在12月及6月、7月,诱发因素主要为上呼吸道感染及瘙痒性皮肤病等,皮损好发部位依次为面部、四肢和躯干。并发烫伤样葡萄球菌感染SSSS2例,占3.8%;52例均未见并发肾炎、脑膜炎和败血症的患儿。2.2新生儿水肿分离结果6年中,在1735例脓疱疮患儿皮损处共培养出A组溶血性链球菌52株,分离率为3.0%。其中在2003年,从235例患儿皮损分离出单纯SA219株,占93.2%,单纯GABHS9例,占0.4%;没有发现SA与GABHS混合感染,还有15例为其他细菌,占6.5%。在2004年,从210例患儿皮损分离出单纯SA184株,占87.6%,单纯GABHS10例,占4.8%,SA与GABHS混合感染3例,占1.4%,还有13例为其他细菌,占6.2%。在2005年,从478例患儿皮损分离出单纯SA392株,占82.2%,单纯GABHS23例,占4.8%;没有发现SA与GABHS混合感染(0%),还有13例为其他细菌,占6.2%。在2006年,从562例患儿皮损分离出单纯SA523株,占93.1%,单纯GABHS13例,占2.7%,SA与GABHS混合感染1例,占0.2%,还有23例为其他细菌,占4.1%。在2007年,从104例患儿皮损分离出单纯SA94株,占90.4%,单纯GABHS5例,占4.8%,没有发现SA与GABHS混合感染,还有5例为其他细菌,占4.8%。在2008年,从146例患儿皮损分离出单纯SA116株,占79.5%,单纯GABHS1例,占0.7%,SA与GABHS混合感染1例,占0.7%,还有28例为其他细菌,占19.2%。2.3药物过敏试验的结果52株GAS对常用抗菌药物的耐药情况,见表2。2.4erma和erma同时存在2003—2008年52株红霉素耐药分离株中,ermB阳性菌株占分离株总数的92.3%(48/52),ermA占7.7%(4/52),未发现ermB及ermA同时存在,无mefA阳性株。2.5早熟型别,最大的emm有在分离的52株菌株中,emm12所占比例最大,为53.85%,随后是emm1,为36.54%,少见型别有emm4.0(1/52,1.92%),emm8.0(1/52,1.92%),emm22.0(1/52,1.92%),emm101(1/52,1.92%)和emm114(1/52,1.92%)。3讨论3.1儿童细胞中gas的分离率其病原菌随年代有何变化。2000年马琳等从246例患儿皮损分离出病原菌233株。其中单纯SA214例,占87.0%;单纯GABHS4例,占1.6%;SA与GABHS混合感染5例,占2%。2004年邓秋连等对2086例脓疱疮患儿分离到的2066株病原菌进行耐药性分析,结果显示,儿童脓疱疮病原菌主要为金黄色葡萄球菌,占96.3%,其次是A组溶血性链球菌,占2.2%。在2010年陈仕胜等报道从253例患者皮损处、咽拭子、血液共培养出病原菌216株,其中A组溶血性链球菌5株,占2.3%,葡萄球菌211株,占97.7%。本文在1735菌中发现GAS52例,总分离率为3.0%,其中每年的分离率波动在0.4%~4.8%,分离率的不同可能与取材季节及数量多少有关,而GAS对头孢类药物仍敏感,此类抗生素的早期或不合理使用,均可影响其分离率。因此,引起北京地区2003至2008年脓疱疮的主要病原菌仍为金黄色葡萄球菌,而A组β-溶血性链球菌仍为引起脓疱疮的较常见病原菌。3.2gas的耐药情况细菌耐药问题已成为世界性难题,不同国家不同地区GAS对大环内酯类抗生素耐药率有很大差别,据报道在韩国GAS菌株对大环内酯类抗生素呈现明显增长的趋势。在匹兹堡的一项研究显示,GAS菌株对红霉素的耐药率为48%,在美国为9.6%,在意大利为35.8%。而在我国,近十余年来GAS对大环内酯类抗生素耐药性不断增长,GAS对大环内酯类抗生素耐药率显著高于其他国家,王辉等报道2002至2003年中国社区呼吸道感染GAS对阿奇霉素的耐药率高于60%,在冯丽娟等报道中,10余年间GAS对红霉素耐药由79.7%升至94%,对克林霉素的耐药由75.4%升至96.9%,在2008年梁云梅等在对重庆北京两地分离自猩红热患者GAS对大环内酯类耐药率高达97.9%;有研究人员发现,健康患儿咽部携带的GAS对大环内酯类的耐药率96.8%。在本研究中,来自北京地区门诊脓疱疮患儿皮损部位分离的52株GAS全部对红霉素耐药,且呈现高度耐药,MIC50、MIC90均大于256mg/L,远高于以往国内外报道,抗生素耐药已经到了警戒的程度,表明北京地区儿童GAS菌株对大环内酯类抗生素耐药性相当严重,这与大环内酯类抗生素在门诊消耗量大有直接关系。以往研究已表明,引起红霉素耐药主要有2种机制:(1)细菌携带ermB,该基因编码甲基化酶,甲基比酶对细菌核糖体23SRNA甲基化,使核糖体结构改变与药物的亲和力下降,从而产生了耐药;(2)另一种机制是携带mefA基因,编码外排泵膜相关蛋白,形成主动外排机制,把抗生素泵出细胞外产生耐药。在欧洲国家中,例如美国、希腊、加拿大的GAS是以携带mefA为主,在本研究中,52株GAS中,有48株表达ermB基因,在我们之前的研究相同,而与国外文献报道有明显差别。造成国家、地区间耐药模式和机制差异的可能原因是流行菌株血清型不同以及不同耐药克隆株流行等,而GAS的ermB常有结合性的转座子携带,并可在细菌之间广泛传播,这也是红霉素广泛耐药的原因之一。青霉素是治疗GAS感染的首选药物,过去70年来一直认为青霉素的MIC值没有增高,本研究中GAS对青霉素及头孢类抗生素仍然敏感,仍可作为一线用药。3.3gas菌株的emm分型M蛋白是GAS主要的毒力因子,到目前为止,已发现120余种根编码M蛋白的emm基因。因此,GAS分型在流行病学研究方面有重要意义。不同国家非侵袭性GAS感染emm基因型别各异,在印度与咽部疾患有关的GAS的emm型别最多见于11,77和81,而与皮肤感染有关的GAS却多见于emm77,emm44,在西班牙最常见的型别为emm1,emm3,emm4,emm12和emm28。而在我国广州地区引起感染性咽炎、扁桃体炎、脓皮病的GAS菌株emm分型,最常见emm1、emm18、emm12,而在Zheng等的研究中,对引起肾炎的68株GAS进行emm分型,最常见者为emm12,emm60,emm63和emm95。在我们之前的研究中,对猩红热、健康携带者以及咽扁株的GAS进行emm分型时,最常见的为emm12,emm1,emm22。由此可见,不同emm基因型别可导致不同疾病,且有国家、地区差异。本次研究显示,GAS以emm12所占比例为最大,(53.85%),随后是emm