血清型前胶原肽测定肝纤维化的临床应用

血清型前胶原肽测定肝纤维化的临床应用

近年来，许多报道认为，血清前胶原（p）p是肝脏钙化的良好诊断指标。测定方法多采用放射免疫分析法(下称放免法),所用抗原从动物胎皮中提取。我们曾报道过从人胎皮中提取、纯化Ⅲ型前胶原(hPCⅢ)并制备抗血清。本文用125Ⅰ标记纯化的hPCⅢ建立放免法,并测定了100例正常人和181例各种肝病和其他病人血清PCⅢ,对肝纤维化的诊断进了临床评价。材料和方法一、标准曲线绘制放免法测定血清PCⅢ的建立:按改良氯胺T法用125Ⅰ标记纯化的hPCⅢ,采用双抗体PEG法:取100μlhPCⅢ标准或待测血清,加100μl抗hPCⅢ血清后于4℃中放置42～48小时,再加100μl125Ⅰ-hPCⅢ(20000cpm),在4℃中放置6小时,然后加100μl二抗和6%PEG,在室温中放置30分钟后离心4000rpm,吸净上清液,测沉淀物放射活性。在半对数纸上绘制标准曲线,以B/B0为纵座标,hPCⅢ标准为横座标。根据待测标本的B/B0即可查得结果。对上述方法进行各项质量指标检测(图省略)。二.临床病理各分组共测定281例血清PCⅢ,分以下各组:1.正常组:健康输血员100例;2.急性病毒性肝炎组:我市传染病医院住院病人22例;全系黄疸型;3.慢性迁延性肝炎组18例;4.慢性活动性肝炎组13例;5.肝硬化组76例:其中代偿性10例,无黄疸、腹水,无明显肝功能损害者;失代偿性20例,以上两类肝硬化患者除10例有病理诊断其余均经临床确诊,并影象学检查排除肝占位病变;合并肝癌46例,有33例经手术病理诊断;6.原发性肝癌(单纯型)组22例,11例有手术病理诊断;7.胆结石组12例,均经手术证实并取肝活检;8.其他组共计18例,其中肝海绵状血管瘤和肝囊肿各3例,肝脓肿1例;非肝病组11例,为慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、肠炎等患者。结果一.批间异系数及回收率125Ⅰ标记hPCⅢ的放化纯度93～98%;标准曲线的竞争抑制关系良好,测定范围较宽为5～1000μg/L;批内和批间变异系数各为5.2%和6.2%;回收率97.6～102.3%,平均99.2%,灵敏度为6μg/L;hPCⅢ与牛胶原(CⅢ)、人I型胶原(CI)和前胶原(PCI)均无明显交叉抑制反应,人Ⅰ型前胶原仅在1000μg/L以上有轻度抑制反应,说明此法特异性较高。二、各组小鼠血清pc正常人和各组病人血清PCⅢ测定结果见表1,分布范围图略。正常组平均值为85.0μg/L(单位下略),正常上限为120。肝硬化组血清PCⅢ升高最显著,其中以合并肝癌组最高,但三组之间统计学上差异不显著(P>0.05)。慢性活动性肝炎组血清PCⅢ升高显著,与慢性迁延性肝炎差异显著(P<0.001);急性肝炎和原发性肝癌(单纯型)略有升高;原发性肝癌(单纯型)肝硬化合并肝癌差异显著(p<0.001);慢性迁延性肝炎、胆石症和其他组均无显著升高。三、无纤维病变者血清pc检测结果本文中37例肝活检标本经H-E染色,按纤维化分布范围和成纤维细胞增生程度分轻、中、重三级,无纤维增生者为O级。其血清PCⅢ测定结果:O级11例为89.5±18.1;轻级10例为135.5±20.5;中级8例为260.8±39.2;重级8例为369.8±68.0。血清PCⅢ随着肝纤维化程度加重而递增,两者呈密切正相关(r=0.984,p<0.001)。血清pp及肝纤维化检测肝纤维化是最常见的肝脏病理改变之一,继续发展可形成肝硬化,进而影响肝实质细胞功能,才出现肝功能的异常。因此,一般常规肝功能试验无法判断轻度肝纤维化或早期肝硬化。迄今临床上主要依靠肝活检检查,但其为创伤性方法,且受穿刺部位的局限性,并难以系统动态观察。因此,近年来肝纤维化标志物的研究引起了人们高度重视。1979年Rohde氏等首先建立了血清PⅢP放免法,并证实对肝纤维化有临床诊断意义。此后国外报道日益增多。1988年在瑞士巴塞尔召开的第七届国际肝病会议上,即有14篇论文集中进行了探讨,一致认为血清PⅢP是目前诊断肝纤维化与早期肝硬化最良好的标志物,并与肝纤维化的活动度呈正相关。国内殷蔚荑等采用西德贝林格公司试剂盒测定各类肝病78例血清PⅢP,结果与国外报告相似。1987年梅长林等从牛胎皮中提取PⅢP,建立放免法测定了133例肝病与13例非肝病,认为血清PⅢP是诊断早期肝硬化有用的标志物。1985年Galambos氏等从山羊胎皮中提纯PCⅢ,建立了直接测定PCⅢ的放免法,并将50例病人的血清PCⅢ与肝活检中纤维化程度进行比较,结果呈正相关,故认为PCⅢ与PⅢP对肝纤维化有相似的诊断意义。本文用125Ⅰ直接标记hPCⅢ建立了放免法,各项质量指标均达到标准要求。用此法测定了181例各种肝病和其他病人血清PCⅢ,肝硬化和慢性活动性肝炎升高最显著(p<0.001);慢性迁延性肝炎,胆石症和其他病人组均无显著升高(p>0.05)。37例肝活检纤维化程度与血清PCⅢ呈密切正相关(r=0.984,p<0.001),此与Galambos氏结果基本一致,以上说明放免法测定PCⅢ对诊断肝纤维化价值是肯定的。大多数高等动物的胶原基本结构与人类相似,具有部分免疫交叉反应,因此多数学者从富含胶原的动物胎皮中提取Ⅲ型前胶原作为免疫测定的抗原。但不同种属动物之间抗原决定簇有一定差异。如Ⅲ型前胶原α1链经溴化氰裂解后,在O、I肽片段上人的主要抗原决定簇在2～5位中的亮氨酸上,而牛则在第11位的苯丙氨酸与13位的亮氨酸上。因此抗原取材于人较动物更为特异。1985年Niemela氏等报道从1例胰腺癌伴腹腔广泛转移的病人腹水中直接提取PⅢP,但取材比较困难。PCⅢ是由细胞内合成后分泌至血中,经内肽酶水解切下的氨基端肽即PⅢP。有些学者认为肝脏发生炎症、坏死等病变时,虽然前胶原合成未增加,而分解代谢增加致使血清PⅢP升高。他们证实血清PⅢP与肝脏的炎症、坏死程度呈正相关,而与肝纤维化的程度相关性较小,甚至无相关,因此对血清PⅢP诊断肝纤维化提出异义,此为目前争论的主要问题。有的文献报道在急性肝炎病人血清中