5-fu和cddp联合诱导人直肠癌细胞凋亡的比较

5-fu和cddp联合诱导人直肠癌细胞凋亡的比较

在这项工作中，我们使用了5-fud-dyn（顺铂）联合使用、5-fu或cdd、1-x射线和5-fud-x射线联合诱导人体诱导细胞坏死程度的差异及其相关基因的表达，并为制定合理的联合排便方案提供理论依据。材料和方法一、肿瘤细胞系统的形成HR8348。用DMEM培养基,加10%的胎牛血清,按常规方法培养。二、cddp与hr-48细胞的作用(一)单一使用5-Fu或CDDP处理细胞:根据预实验、文献报道及临床应用剂量,选择工作浓度分别为0、20、60、100mg/L的5-Fu(上海旭东制药有限公司)和工作浓度分别为0、0.4、1.2、2mg/L的CDDP(山东齐鲁制药厂)分别与HR8348细胞共同作用5、20、25、40、50h后,常规消化离心收集固定细胞。(二)5-Fu和CDDP联合作用处理细胞:选择工作浓度为60mg/L的5-Fu,1.2mg/L的CDDP和60mg/L5-Fu+1.2mg/LCDDP与HR8348细胞共同作用5、20、25、40和50h后,按上述方法处理细胞。三、射野大小比较经Varian6MV-X线直线加速器进行照射,剂量率为250cGy/min,源皮距为100cm,射野大小为32.6cm×30.5cm。分别给予细胞0、2、4、8和10Gy剂量的照射。四、cddp对小鼠细胞的细胞毒性作用照射前分别以60mg/L5-Fu,1.2mg/LCDDP和60mg/L5-Fu+1.2mg/LCDDP处理细胞,然后,再分别给予0、2、4、8和10Gy不同剂量的照射。五、荧光显微镜观察将处理后的细胞加Hoechest33342荧光染液室温作用10min,荧光显微镜下观察计数凋亡指数。六、共同语言和琼脂糖凝胶电泳七、参考文献表明tune检测dna错误八、免疫组化方法九、观察视野及色反应分析阳性结果为棕黄着色,其中p53基因表达的蛋白产物位于细胞核内,bcl-2基因表达的蛋白产物位于胞膜及胞浆内每个样本于光镜下(40×)随机选择三个视野,计数阳性细胞数。每一样本均经两个人观察核实。根据着色强度分为三级,蓝色(-)、黄色(+)、棕黄色(++),着色深度以多数细胞的呈色反应为准。每次实验设对照,阴性对照组为未加抗体组,阳性对照组为鼻咽癌低分化鳞癌p53、bcl-2强阳性(++)病理切片不同处理对5-tf-cddp细胞凋亡的影响一、单一使用5-Fu或CDDP对肿瘤细胞凋亡的影响单一使用5-Fu或CDDP诱导的细胞凋亡水平随着药物浓度的增加和药物作用时间的延长呈逐渐上升趋势,CDDP诱导的细胞凋亡水平高于5-Fu,但在40h以后,CDDP组细胞坏死比例的增加致细胞凋亡比例下降。5-Fu组细胞40h以后没有出现明显的坏死,但细胞凋亡水平没有明显增加。二、5-Fu和CDDP联合作用对肿瘤细胞凋亡的影响结果见图1显示,5-Fu-CDDP联合作用诱导的细胞凋亡水平在一定的时间范围内(约25h)高于单一的5-Fu或CDDP,但随着药物作用时间的逐渐延长,5-Fu-CDDP联合作用组细胞坏死比例逐渐增高,凋亡比例反而低于单一的5-Fu或CDDP。三、射线与5-Fu-CDDP联合作用对肿瘤细胞凋亡的影响从图2可见,X-5-Fu-CDDP组细胞凋亡比例明显高于X-射线、X-5-Fu、X-CDDP组,但随着照射剂量的增大,细胞坏死的增加,凋亡比例呈逐渐下降趋势。四、免疫组化染色结果未处理组细胞的p53蛋白和bcl-2蛋白均呈现高表达,阳性细胞比例达90%,呈棕黄色染色。p53主要分布在胞核,bcl-2主要分布在胞浆。经不同因素处理后的细胞,p53及bcl-2阳性细胞的百分率下降不明显,阳性程度均有不同程度的下降,与未照射组相比,由(++)降为(+)。但各组之间没有明显区别。五、凋亡的检测同一剂量2Gy的X-射线照射细胞,加不同治疗方法(X-射线-5-Fu及X-射线-5-Fu-CDDP)处理细胞,于37°C孵育6h行琼脂糖凝胶电泳,可见有典型的DNA“ladder”出现。同时,我们将按上述方法处理的细胞于37°C孵育24h后行TUNEL,各点均呈明显的阳性结果。x-损伤的联合作用近年来,细胞凋亡研究的日益深入使人们认识到诱导肿瘤细胞凋亡是许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长、促进其死亡的主要机制。经本实验研究表明,5-Fu和CDDP诱导的人直肠癌细胞的凋亡具有明显的时间-剂量相关性,且二者联合应用,较单一使用5-Fu或CDDP凋亡水平高,提示二者具有相加或协同作用。X-5-Fu-CDDP的细胞凋亡水平要远远高于X-射线、X-5-Fu及X-CDDP组,说明5-Fu-CDDP具有很明显的放疗增敏作用。这将为临床综合治疗直肠癌提供新的理论依据。值得注意的是,在我们的研究中还发现,CDDP诱导的细胞凋亡水平在5h、20h、25h、40h高于5-Fu,在50hCD-DP对细胞的影响逐渐以细胞坏死为主,5-Fu没有明显的细胞坏死倾向,但细胞凋亡水平较40h并没有很明显的提高。这提示随着药物浓度的增大和药物作用时间的延长,5-Fu和CDDP对细胞的影响由诱导细胞凋亡向阻止细胞增殖、引起细胞坏死方面转化。同样地,5-Fu-CDDP及X-5-Fu-CDDP的联合作用也证明了这一点。我们认为,阻止细胞增殖和诱导细胞凋亡是许多抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的两种途径,至于在何种情况下细胞发生增殖或凋亡,可能与化疗药物的浓度或药物作用时间有关。此外,未经处理组呈现mtp53和bcl-2的高表达,施加各种处理因素后,mtp53和bcl-2均有一定程度的基因表达下调,表明在X-射线、5-Fu及CDDP诱导细胞凋亡的过程中,抑癌基因p53和原癌基因bcl-2都参与了细胞凋亡的基因调控。但是,在各处理组间并未有非常明显的差异。我们认为,由于细胞凋亡涉及一系列基因表达的级联反应,在不同因素诱导细胞凋亡的过程中,可能启动了一系列凋亡相关基因的参与,它们相互协同,共同调节凋亡过程,仅单一基因的变化不足以影响细胞凋亡。总之,通过本实验,我们主张X-射线-5-Fu-CDDP联合应用可作为直肠癌