常用生物学实验技术课件

常用生物学实验技术

目的

一、生命科学相关实（试）验内容二、常用生物学实验技术三、实验室安全一、生命科学相关实（试）验内容临床试验：在人体进行药物的研究，明确药物的作用、不良反应、药代动力学，确定药物的疗效与安全性。临床试验一般分为I、II、III、IV期临床试验。也包括细胞及其他生物制品、外科治疗、放射治疗、医疗器械、行为疗法对象：人伦理：伦理委员会，知情同意伦理委员会批准--赫尔辛基宣言1964年世界医学协会通过赫尔辛基宣言关于进行人体医学研究的准则和方法。1975年、1983年、1996年修订，2000年重新修订，特别强调了人体医学研究中对特殊人群和弱势人群权益的保护。临床试验分为I、II、III、IV期。上市前，I、II、III期临床试验上市后，IV期临床试验I期临床试验：初步的临床药理学及人体安全性评价试验。观察人体对于新药的耐受程度和药代动力学，为制定给药方案提供依据II期临床试验：治疗作用初步评价阶段。

目标适应症患者的治疗作用和安全性

试验设计多样化（如随机盲法）。III期临床试验：治疗作用确证阶段。

为药物注册申请的审查提供充分的依据。试验一般应为具有足够样本量的随机盲法对照试验。IV期临床试验：新药上市后的应用研究阶段。药物的疗效和不良反应、改进给药剂量。样本含量估算方法《药品注册管理办法》对临床试验病例数的规定：Ⅰ期为20～30例，Ⅱ期为100例，Ⅲ期为300例，Ⅳ期为2000例。临床试验注册/cn//基础实验

个体基因蛋白细胞DNA和RNA提取PCR、核酸杂交芯片、基因工程测序等免疫组化印迹杂交测序ELISA等细胞培养活率、凋亡流式细胞等动物实验临床试验二、常用生物学实验技术（一）基因相关技术

（二）蛋白质相关技术（三）细胞培养技术（四）动物实验（一）基因相关技术核酸提取表达检测PCR、原位杂交、膜杂交（Northern-Blot、Southern-blot）基因工程转基因细胞或动物、工程化抗体或疫苗制备基因研究简史1838年发现蛋白质，1869年发现DNA19世纪1910发现染色体上存在基因1941基因可以编码蛋白酶1944DNA是最基本的遗传物质1953DNA双螺旋结构1961认识mRNA1966发现遗传密码1972体外合成DNA1973克隆DNA发现转录酶19731977DNA测序技术20011986创建PCR技术小干扰RNA（miRNA）1993人类基因组计划2006非编码RNA（noncodingRNA）的调控作用基因研究的临床应用1.小分子分子靶向药物肺癌—吉非替尼、厄洛替尼片2.血液学标志物如肿瘤标志物3.单抗药物风湿病—IL6抗体、TNFa抗体，4.基因治疗

如B细胞性淋巴瘤、白血病CAR-T（CD19、CD20）DNA的操作DNA的来源：新鲜、石蜡包埋组织、血液、体液、毛发、质粒、细胞、微生物、植物DNA抽提试剂：苯酚/氯仿法、试剂盒（吸附柱）原理：裂解原材料（酶、碱）、分离DNA和其他成分、

离心分离、除分离液成分注意事项：彻底裂解、小心抽吸、

取材应在试剂能力范围内Qiagen试剂盒操作步骤裂解结合一洗二洗洗脱收集浓度测定：紫外分光光度仪（OD260和OD280）完整性检测：琼脂糖凝胶电泳依据OD260值计算DNA浓度RNA抽提步骤和DNA类似RNA非常容易降解，减少操作时间；所用试剂、耗材要无RNase标本低温处理（液氮、冰上），抽提过程低温（6-10℃）。RNA在无水乙醇、Trizol中-80℃保存2-3年建议使用匀浆机X

√PCR技术PCR—聚合酶链反应利用酶的作用+特殊的引物，可在体外复制特定区域的DNA片段常用PCR种类：1.逆转录PCR(RT-PCR)：以由mRNA逆转录而来的DNA为模板，检测基因的mRNA表达量。2.热启动PCR(hotstartPCR)：以高热活化型核酸聚合酶进行反应，提高PCR特异性。3.实时定量PCR(real-timePCR)：PCR过程中利用萤光探针或染料定量检测靶基因的表达量。4.巢式PCR(nestedPCR)：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。5.多重PCR(multiplexPCR)：在同一个管中使用多组引物。PCR技术主要用于基因表达水平的检测（DNA、mRNA）mRNA表达量的检测，需要先将提取的RNA或mRNA反转录成cDNA。反应成分：反应液（Mg2+）、模板、引物、TaqDNA合成酶、dNTPs热循环：热变性、退火、延伸，20-40循环。引物设计：20nt左右，二聚体、发夹结构，横跨内含子产物：数十个碱基（探针法）；<500碱基（sybrGreen）扩增循环数：30个左右引物设计软件：在线、Primerprimer5、OligoRT-PCR的引物设计（防止DNA污染）核酸杂交技术原理：核酸双链的变性、解链、复性、再结合Northern-blotRNASouthern-blotDNA原位杂交（细胞、组织切片）（RNA或DNA）全基因组测序SNP即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点，是继微卫星之后的第三代遗传标记。有些SNP位点还会影响基因的功能，从而导致生物性状改变甚至致病。全基因组关联研究（GenomeWideAssociationStudies,GWAS）是一种检测特定物种中不同个体间的全部或大部分基因，从而了解不同个体间的基因变化有多大的一种方法基因芯片1.基因芯片（Genechip）又称DNA芯片(DNAchip)，DNA微阵列（DNAmicroarray）2.蛋白芯片（Proteinchip）3.其他芯片细胞芯片、组织芯片、糖芯片及其他类型的生物芯片基因芯片的新发展

基因组（比较基因组等）

转录组（表达谱、miRNA、lncRNA芯片等）Affymetrix：世界上最早的芯片公司/

国内芯片公司：博奥、欧易Mammaprint：第一个被FDA批准的临床基因芯片70个乳腺癌相关基因，用于判断转移

和复发危险度。基因克隆和载体技术基因克隆（genecloning）:把基因片段通过无性繁殖转到另一个生物体内的过程。基因克隆技术:

包括基因的获取、基因的重组、基因的克隆化和基因的表达等。蛋白质工程：基因克隆下游的相关技术转基因方法感染通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞转染通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。显微注射磷酸钙沉淀电穿孔脂质体RNA病毒逆转录病毒、HIVDNA病毒腺病毒、腺相关病毒选定目的基因载体的选择

克隆载体表达载体

原核真核质粒、粘粒

噬菌体

病毒病毒载体特点病毒作为基因转移是基因递送良好的工具，病毒载体的优点有：（1）在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分；（2）可能将有缺陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分，并能进行分离；（4）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2500bp。目前常用的病毒载体有下列几种。基因工程下游技术工程菌大规模发酵参数新型生物反应器高效分离介质及装置的开发分离纯化的优化控制生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造基因敲除基因敲除是将基因组中特定基因去除、替代、灭活，然后从细胞或整体水平观察基因的功能。基因沉默（genesilencing）常用RNAi技术，细胞水平基因敲除（geneknockout）常用Cre-loxP技术，动物体内研究，如动物基因缺陷模型（二）蛋白相关实验技术PAGE电泳Western-blotELISA免疫组化组织荧光PAGE电泳和双向电泳介质：聚丙烯酰胺原理：分子量大小（分子形状）电流染色（丽春红、考马斯亮蓝、银染）按等电点先分离第一向，按分子量分离第二向Western-blot蛋白质印迹检测细胞、组织中特定蛋白的表达量用抗体检测，属免疫学检测手段之一原理：抗体-抗原结合X光片成像仪同位素荧光素Westernblot技巧蛋白不能降解（冰上操作、用蛋白酶抑制剂）断裂核酸（针头抽吸、超声破碎）一抗选择很重要抗体浓度要摸索二抗浓度不易太高ECL要适量蛋白降解蛋白完好曝光过度曝光适当免疫组化应用免疫学和组织化学技术，对特定抗原（蛋白）进行定性、定量、定位检测。标本：组织切片（固定、冰冻）、细胞涂片、爬片。试剂：抗体、显色剂等显色：DAB、NBT/BCIP、荧光等。注意事项：内源性生物素干扰、控制显色时间、设立对照ELISA用酶标记抗体（或抗原）在体外与抗原（或抗体）结合，通过相应底物被酶解后出现显色反应，定量检测抗原（或抗体）。特点：灵敏、特异类型：双抗体夹心法、竞争法、间接法等双抗体夹心法竞争法间接法蛋白芯片蛋白芯片：原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（三）细胞培养和检测技术从体内组织取出细胞，在体外模拟体内环境下使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群，或者组织、器官。原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。无菌操作细胞培养间超净工作台或生物安全柜紫外光或臭氧消毒灭菌微孔滤膜培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞密度抑制恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（DensityInhibition）。细胞冻存和复苏冻存和复苏的原则：慢冻快融细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化（30-40代）。标准程序：细胞冻存器当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。细胞活力检测克隆形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成用来表示细胞的增殖能力

克隆形成率＝克隆形成数／接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠台盼兰染色活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力活细胞总数×100活细胞率（％）＝活细胞总数＋死细胞总数MTT比色法

是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。CCK-8比色法1.产生的formazan都是水溶性，检测灵敏度更高。2.更加稳定，酚红和血清对其测定无明显影响

对细胞无明显毒性，3.加入显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间注意事项微生物污染细菌支原体污染真菌污染湿度温度宁低勿高CO2浓度宁酸勿碱流式细胞学检测FITC-AnnexinV检测试剂盒活细胞，磷脂酰丝氨酸（PS）位于胞膜内，在凋亡的细胞，PS翻转到细胞膜外表面，Annexin-Ⅴ能与PS高亲和力结合胞膜胞内蛋白检测细胞膜或细胞内蛋白表达侵袭和迁移实验侵袭实验：常用8.0、12.0µm膜。上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。趋化/迁移实验：常用5.0、8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高