东亚鲑胚胎发育过程的观察

东亚鲑胚胎发育过程的观察

胚胎发育是一个相对复杂的过程。细胞的复制和分裂同时发生，但速度不同。HalaŁka把棕鳟(Salmotruttafario)胚胎的发育从受精到孵出描述为9个阶段,而Killeen等将棕鳟胚胎的发育从受精到卵黄吸收结束分为40个连续的过程,并加以量化。在胚胎发育过程中,温度直接影响发育的速率;通常在一定的温度范围内,温度越高,发育越快,但并非总是呈线性增加。一些对鲑科鱼类胚胎发育的研究显示:就整个发育过程而言,温度引起胚胎外包、心跳的出现、臀鳍形成、骨骼和消化系统的形成、色素沉着和孵化在时间选择上的变化。而另一些研究则发现温度对胚胎发育的解剖学结构的形成时间没有影响。除了温度,其它的外在因子,如溶解氧、盐度、光照等同样会影响胚胎的发育和成活率。亚东鲑(SalmotruttafarioL.)因其生长在西藏的亚东河而得名,原产欧洲,后引入我国,亚东鲑具有较高的营养价值和经济价值,深受当地群众的青睐,已被西藏自治区列为受保护、重要发展的鱼类之一。近年来,由于人为捕捞已经造成亚东鲑在河流中的种群数量明显下降。本文研究了亚东鲑胚胎发育的特点,以期为进一步的人工繁殖和增养殖提供科学依据。1胚胎发育分期和孵化用水的选择实验用鱼由西藏自治区亚东鲑养殖站提供。亲鱼是从亚东河捕捞并驯化的成鱼,经人工繁殖的受精卵放入孵化槽中进行流水孵化。每天定时取样,显微镜和解剖镜下直接观察;在胚胎发育的囊胚期之前,每隔2h取一次样,然后每天取样两次,到第30天之后每天取样一次,并记录各发育期的主要特征、描图。早期胚胎发育的分期主要参照Ballard、HalaŁka、Killeen等对鲑鳟鱼类胚胎发育观察记录的分期,但发育的某些过程并不一致。有些受精卵分辨不清,就将其用Stockard氏溶液先处理一段时间,然后破坏卵膜取出胚胎进行观察。观察的同时,用95%酒精和Bouin氏液分别固定一部分样品,以备复查和切片观察。孵化用水的选择,1999-2000年和2000-2001年孵化用水为高山雪融水,高原气候昼夜温差大,水温受高原气候的影响昼夜温差变辐明显。而2002-2003年孵化用水为一股山泉水,水温变化幅度小。所以我们每天对水温进行八次测量再求平均值作为孵化水温。胚胎发育积温是按度·日计算的,即累积温度=日数×温度。平均受精率是受精后积温达到100度·日时随机取样放入鉴别液中,肉眼观察有白色线状胚体的卵,即为受精卵,三次平均求平均值。绘图用Photoshop7.0软件,数据用EXCEL处理。2结果2.1卵1红色,0.4mm不等亚东鲑成熟卵呈圆球形,卵径视鱼的个体而变化,为2.0～5.4mm不等。卵呈黄色、红色或者桔红色。卵黄较大,几乎占据所有卵内空间,卵的比重比水大,为沉性卵,稍带粘性。2.2卵黄囊胚的发育卵裂期(cleavagestage)刚受精的卵卵质较为均匀,没有什么变化(图版-1)。卵受精后立即吸水膨胀,体积增大,2～3h之后体积增至最大。6～8h,原生质被卵黄挤压集中在一端且较小,即动物极,并在卵黄囊上方隆起,形成一半椭圆形小丘状或者帽状的胚盘。胚盘较为清晰,略带红色。而胚胎的其它部分全部为卵黄充满,只能看到卵黄表面大小不等的油滴,此为1细胞期或胚盘期(图版-2)。受精后8～23h,受精卵在胚盘中央出现1条模糊的分裂沟,随着分裂沟的不断加深,逐渐形成两个大小相似的分裂球,分裂球纵裂(分裂面与胚盘相垂直)将胚盘一分二,此期即2细胞期(图版-3)。23～30h,完成第二次分裂,形成4细胞期(图版-4)。受精后30～49h,完成第三次分裂,进入8细胞期(图版-5)。离受精42～54h,胚胎发育进入16细胞期(图版-6)。此时分裂球仍处在同一平面上。受精后50～72h,分裂球进一步分裂变小,排列也不如以前整齐了,此期为32细胞期(图版-7)。受精后3～5d,不同步分裂的速度加快,胚盘的高度进一步增加。在卵黄囊上形成一个隆起的细胞团,即为多细胞期(图版-8)。此时细胞之间的界限已经更模糊。在卵裂的晚期,离受精6～8d,位于胚盘中间的细胞分裂速度大于边缘的,但边缘细胞的体积较大,此为桑椹期(图版-9)。囊胚期(blastulastage)受精后8～10d,随着卵裂的继续进行,且分裂球的数量和层数更加增多,胚盘上的细胞愈分愈小。由多层细胞形成的囊胚层在卵黄囊上高高隆起,呈半圆球状,此为早期囊胚(图版-10)。此期位于胚盘中间的分裂球在解剖镜下已不能再分辨出个别的细胞,而位于边缘较大的分裂球仍能看到。受精后10～12d,囊胚细胞层的高度逐渐降低。呈一饼状,此为中期囊胚(图版-11)。受精后12～15d,囊胚层继续降低变薄,整个囊胚呈扁平帽状紧贴于卵黄囊上,内部形成一空腔,此为晚期囊胚(图版-12)。胚盘较低的边缘不再以一定的角度与卵黄相接触,不过仍靠近卵黄的边缘。原肠期(gastrulastage)晚期囊胚后随着胚层的向下扩张,囊胚边缘开始下包,胚胎发育进入原肠阶段。至受精后15～17d,胚盘的边缘部分增厚,并朝植物极方向推进,下包边缘由于细胞的集中而形成明显增厚的一圈,即胚环,胚胎进入原肠早期(图版-13)。受精后17～19d,囊胚细胞以内卷的方式在卵黄囊顶部隆起,胚盘背部中线处形成增厚的胚盾,胚体雏形开始形成,胚胎进入原肠中期(图版-14)。受精后19～20d,胚盘继续下包逐渐达到卵黄囊的2/3处;胚盾伸长,其前端形成稍为膨大的脑泡原基,胚胎进入原肠晚期(图版-15)。未被包被而裸露在外的卵黄以后将形成卵黄栓,此后的胚环也逐渐闭合为胚孔。神经胚期(neurulastage)受精后20～23d,胚盾继续伸长,神经板逐渐形成。神经沟的存在标志神经胚开始初步形成。此时的胚胎为神经胚,此期为神经胚期(图版-16)。在神经板形成期的开始阶段,早期的神经板是沿胚盾中纵轴增厚的组织。在此期末,胚胎前面的部分明显变得比更后面的部分较宽,是以后脑形成的地方。体节形成期(somitogenesisstage)受精后20～23d,在胚盾长轴的1/2～2/3处,1～3对体节开始发育,但是非常难分清。前面的眼原基也可看到(图-17)。受精后24～27d,在脑分化的早期,从侧面观察,胚胎的前端开始分化为前、中、后脑3部分。体节5～9对左右(图版-18)。受精后27～30d,胚层进一步下包,并在卵黄栓末端形成圆形胚孔,胚层合拢,胚孔封闭,此期为胚孔封闭期(图版-19)。体节10～15对左右。发育至30～33d,在后脑侧面形成眼基板,16～20对体节形成,神经管的腹侧形成脊索。在此期末,增厚的部分以后是发育形成围心腔的地方(图版-20)。受精后33～35d,在每个眼基板的前背区形成沟槽,最后在外胚层区域形成晶状体。除了后脑的最前部之外,其余的都分为5个明显不同的神经管原节。在卵黄囊表面形成围心腔。21～26对体节形成。第4～7对体节的腹侧,成对形成原肾管(图版-21)。受精后35～37d,第5～12对体节从简单的长方形逐渐变成“V”形,形成第26～32对体节。在大多数胚胎中随围心腔室扩大,心脏和胃也开始变得清晰,心脏在中间稍微凹入,标志心房和心室开始分化(图版-22)。尾芽期(tail-budstage)受精后37～39d,尾芽开始从卵黄表面分离出来,心脏在中间向前倾。心脏开始轻微跳动,鳃盖和第一鳃弓慢慢可见,发育中的晶状体开始从周围的视觉杯中分离。脊索细胞依前后顺序发育成较大的空泡,33～37对体节形成(图版-23)。发育至39～41d,心脏跳动变得有力,心跳次数逐渐增加,每分钟达56次,足以能推动血液在血管中流动,38～43对体节形成(图版-24)。肌肉效应期(muscularcontractionstage)受精后41d,肉眼或者解剖镜下可看到胚胎躯干肌肉自发的开始蠕动。此时血液已经在血管内从前向后的流动,血液的颜色也开始泛红,第44～47对体节形成(图版-25)。眼点出现期(eyedstage)受精后42～45d,在视杯的背缘色素的出现标志此期的开始,眼囊内逐渐有大量的黑色素沉着,使眼囊呈黑色。卵黄囊静脉向外扩展到卵黄表面。头开始脱离卵黄。嗅基板在眼前部发育,第3～4对鳃弓出现。48～55对体节形成(图版-26)。耳石期(otolithsstage)受精后46～52d,耳囊中形成耳石标志此期开始,最好是通过光线的明亮区域观察。在血管和心脏中,血红蛋白使血液开始变成粉红色。整个卵黄表面有血管分布的地方已经变成浅红色,55～60对体节形成(图版-27)。卵黄囊液泡化—出膜期(yolk-sacvascularization-hatchingstage)受精后52～56d,肠动脉,内脏毛细管,中轴静脉和成对的后主静脉形成,视杯周围的黑色素达到脉络膜裂沟边缘,胸鳍向后倾斜。在远离下颚后面,头脱离卵黄。1/3～3/5的卵黄囊形成液泡(图版-28)。受精后59～62d,在每个耳囊中的3个半规管原基开始发育,在前两对鳃弓中出现血液循环,更深的节间血管以一种非常不规则的顺序出现,2/3～3/4的卵黄囊形成液泡。至受精63～66d,身体色素开始形成,在鳃盖后部,头脱离卵黄,暴露出心脏。前面大部分的鳃弓开始发育进入腮裂。尾鳍和腹鳍原基出现,背鳍逐渐开始发育,可看到在第21～26对体节处间叶组织增加,背鳍和臀鳍鳍褶变大,大部分的卵黄囊已经形成液泡(图版-29)。受精后67d,在前脑表面出现血管网,从第三、四对鳃弓上开始出现血液循环,臀鳍和背鳍原基出现。到受精后72d,覆盖胚胎嘴部的膜也已经消失。受精后74d,超过9/10的卵黄囊形成液泡。肉眼可看到胚胎在卵膜内来回扭动,此时卵膜变薄,易破。受精后77d,尾鳍鳍条开始发育,1～3个尾鳍鳍条出现(图版-30)。胚胎在臀鳍中已经形成了3～5个肌肉芽,在背鳍中已有了6～8个。背鳍褶开始向未来脂鳍处扩展,此时第一鳃弓已经被全部鳃盖覆盖。载黑素细胞在前脑上开始出现。受精后79d,卵膜破裂,胚胎开始孵化出膜(图版-31)。出膜时,尾部首先穿出卵膜,而头部仍在卵膜内,尾部不断摆动,然后头部也脱离卵膜。出膜的仔鱼体长在11.5～14.4mm[平均(13.09±0.90)mm]之间。带有较大的卵黄囊,身体平直,自然下沉于孵化器的底部。卵黄囊呈椭圆形,直径3.3～5.6mm不等。躯体由鳍褶包围,胸鳍近圆形,且腹鳍和脂鳍胚芽仍未明显分开。受精后95d,大部分胚胎已经出膜,到受精后104d已全部出膜。2.3平均水温与受精率对连续3年的胚胎发育情况作一比较,从表1中可以看出,平均水温在4.3℃下,胚胎从受精到出膜时发育所需要的积温比平均水温3℃时低,而稍微高于3.3℃时的积温,但是全部出膜时的积温比较高。在3种水温下,受精率没有显著的差异。从孵化率来看,平均水温4.3℃时的孵化率要高于3.3℃和3℃时的平均值。2.4水土流失较多,影响了胚胎的正常代谢从图1、图2中可以看出,1999-2000年和2000-2001年孵化用水的水温月季变幅较大。孵化前期水温高,1-2月水温最低,3月后水温回升,这样的水温可能更接近于亚东鲑自然繁殖的水温。2002-2003年人工繁殖采用的是一股山泉水,从图3、图4中显示整个孵化期间水温变幅较小,且每日温差也不大,这样的水温可能更有利于胚胎的发育。本次孵化用水为一股山泉水,经过三层纱网过滤,并没有其它特别的处理,水中含有较多的悬浮物和杂质。孵化中,可经常看到在受精卵的表面粘附着较多的悬浮物。这在一定程度上影响了胚胎的正常新陈代谢,也是造成胚胎死亡、孵化率不高的原因之一。图5中显示,2002-2003年胚胎发育天数与积温之间存在明显的线性相关,表明整个发育期间水温处在一个相对稳定的状态,波动不大,对于亚东鲑早期的胚胎发育,相对稳定的环境水温可能更有利。3讨论和结论3.1东亚鱼的人工诱导繁殖亚东鲑自然繁殖一般是在秋冬季产卵于缓流浅水处,产卵后将卵用沙覆盖起来,在不被外界光线直射的地方进行孵化,这是亚东鲑对孵化环境的一种适应性表现。亚东河秋冬季水流较小,亚东鲑产卵场范围也很局限,水温较低,自然孵化的过程较长。亚东鲑的人工繁殖在1998年已经获得成功,其人工繁殖一般在每年的11月底至12月中旬进行。从2002-2003年的孵化结果来看:共用亲鱼392尾,雌鱼为216尾,其中5尾还未完全性成熟,体重在300～2000g之间;雄鱼176尾,全部达性成熟,体重在260～2800g之间;受精率为93%,但孵化率仅有72%。造成孵化率偏低的原因可能跟整个发育过程中水质的情况以及水温昼夜变化有关系。3.2东德酸亚鱼胚胎发育的水岸期和发育稳定期鱼类胚胎发育具有种的特异性,主要受遗传因素的影响。根据胚胎发育的外部形态及典型特征,我们将亚东鲑胚胎发育过程分为10个时期,每个时期又分为不同的亚时期。在平均水温4.3℃下,亚东鲑胚胎发育在尾芽期之前各期出现的顺序均相应晚于Killeen等对胚胎发育的报道,肌肉效应、眼点的出现却早于以后各期的出现,之所以出现这种情况可能与亚东鲑进入高原河流中的生态适应性有关。眼点出现较早,缩短了胚胎发育的敏感期,较早进入胚胎发育的稳定期,以便减少外界环境对它的影响,有利于提高后代的成活率。最早出膜的卵发育积温(表1)却低于Killeen等的报道,但亚东鲑鱼卵全部出膜的积温比较高。3.3红点鳌的发育温度对红点鱼胚胎发育的影响环境因素能够影响鲑鳟鱼类卵的存活、孵化时间和仔鱼(从孵出到上浮的一段时间)的发育、上浮以及鱼苗(上浮,能够自由游泳的幼鱼)的存活率。其中水温对胚胎发育的影响最为直接。对于秋冬季产卵的鱼类如棕鳟、北极红点鲑能够忍耐一个更低的胚胎发育水温。Ojanguren和Bra†a研究发现,棕鳟胚胎发育的上限温度是14～16℃,在16～18℃没有卵能够发育。我们的研究结果表明,在接近0℃(发育期间,记录的最低温度为0.15℃,1999-2000年)温度下,亚东鲑同样能够正常发育。但在孵化期间,水中的悬浮物和杂质较多,在一定程度上影响了胚胎正常的新陈代谢,可能是造成胚胎死亡、孵化周期延长的原因之一。3.4