野生杜鹃杂交胚初代培养基及萌发特性研究

野生杜鹃杂交胚初代培养基及萌发特性研究

中国现有的杜鹃品种主要通过芽品种选择，很少通过杂交育种获得。利用当地资源和繁殖对中国杜鹃花品种的发展极为重要。杜鹃远缘杂交同时存在受精前、后障碍,受精后障碍主要表现为胚珠停止发育,种子不能发芽和后代白化苗等情况。受精后障碍的克服,可通过未成熟种子的培养来进行胚拯救,提高种子的萌发率及成苗率。URESHINO等以Anderson为基本培养基对常绿杜鹃和日本落叶黄花杜鹃的杂交胚进行了胚拯救。Anderson、WPM等培养基在杜鹃杂交胚拯救中也有所应用。但针对杜鹃不同杂交组合,最适培养基类型的研究还鲜见报道,尤其是国内有关杜鹃杂交胚的组培技术还未见报道。仅刘燕等以1/4MS为基本培养基,对大白花杜鹃(R.decorum)的种子胚进行了组培配方的探讨。不同杂交组合由于母株营养状况、杂交亲和性等的差异,杂交胚的发育存在显著不同,确立胚拯救的适宜时期显得尤为重要。EECKHAUT等在自交授粉4~5月后进行了杂交胚的组织培养,但个别杂交组合的种子在授粉1.5~2月后就被采收、组培。不同的杜鹃杂交组合最佳拯救的胚龄不同,不同基因型间的萌发率也有差异。MICHISHITA等认为杂交授粉4个月后,是杜鹃杂交胚拯救的适宜时期,但他们也发现不同胚龄、不同基因型的杂交胚的萌发率存在显著差异。因此本研究针对杜鹃杂交胚的败育现象,以杜鹃若干杂交组合的杂交胚为试验材料,比较了基本培养基类型及胚龄、基因型等对杂交胚萌发状况的影响,对我国野生杜鹃杂交胚的初代培养进行了初步探讨,以期提高我国杜鹃杂交胚的萌发率,促进杜鹃杂交育种进程。1材料和方法1.1细胞培养和转染2011年4月杜鹃花期,以南京地区栽培的映山红(R.simsii)和锦绣杜鹃(R.pulchrum)为母本,自交的同时,与采自昆明植物园的映山红(R.simsii)、白花杜鹃(R.mucronatum)、窄叶杜鹃(R.araiophyllum)和薄皮杜鹃(R.taronense)杂交,如表1所列,共配置8个杂交组合,进行杂交授粉。授粉3个月后采集蒴果,用75%乙醇消毒30s,无菌水冲洗3遍,再用10%NaClO消毒15min,无菌水冲洗5遍后剥胚,接入到MS,1/4MS,WPM,改良的Anderson4种不同培养基中进行组培,基中蔗糖50mg/LGA3,30g/L蔗糖,8g/L琼脂,pH值5.0。光照12h/d,光照强度1600lx,温度250.5℃。培养40d后统计萌发率,并转瓶1次,均转接到各自的原基本培养基中(污染的除去,不计入总数);培养40d后再次统计萌发率。1.2培养基的萌发率表2所列不同的杂交组合,在杂交授粉3个月后(部分杂交组合在授粉2,3,4个月后),收集杂交蒴果,按照1.1的灭菌方法进行灭菌,剥胚,以WPM为基本培养基(添加50mg/LGA3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂)进行培养,中间没有转瓶,通过添加灭菌的WPM+30g/L蔗糖的培养液来补充营养。培养条件如1.1相同。培养30,60d后统计萌发率,3个月胚龄的杂交胚在最终培养120d后,统计萌发率,出苗率和出愈率,而4个月胚龄的杂交胚最后一次统计是在最终培养90d后。基因型探讨中的最终数据是在培养120d后统计的。萌发率=(萌发成苗+形成愈伤)的个数/接入的总杂交胚数×100%;出苗率=萌发成苗的个数/接入的总杂交胚数×100%;出愈率=形成愈伤的个数/接入的总杂交胚数×100%。2结果与分析2.1不同培养基中杂交胚萌发率的比较包括锦绣杜鹃自交在内,锦绣杜鹃为母本的3个杂交组合的杂交胚在培养40d后,杂交胚都已部分萌发,并且随着培养时间的延长,萌发率也在提高(表1)。在这3个杂交组合中,自交胚的萌发率较低。而映山红为母本的5个杂交组合中,映山红×窄叶杜鹃的杂交胚完全没有萌发,映山红×薄皮杜鹃的杂交胚在培养80d后,仅在MS培养基上有极少量萌发(2.9%),映山红自交胚的萌发率也比较低,但映山红与异地种源父本的杂交胚萌发速度较快,萌发率也最高。映山红×白花杜鹃的杂交胚虽然萌发速度较慢,但培养80d后杂交胚的萌发率达到35%~55%。以上结果表明,不同杂交组合杂交胚之间的萌发率有很大差异。同一杂交组合在不同培养基中的萌发率显著不同,锦绣杜鹃×映山红的杂交胚在MS,1/4MS培养基中的萌发率最高,达55%以上,在WPM培养基中萌发率也有45%;锦绣杜鹃自交、锦绣杜鹃×白花杜鹃、映山红×白花杜鹃的杂交胚在WPM培养基中的萌发率较好;映山红异地种源杂交胚在4种培养基中的萌发率都比较高,其中在WPM与MS培养基中的萌发速度快,萌发率也比较高,尤其是在MS培养基中;映山红自交胚在WPM,MS及1/4MS培养基中萌发率高于改良Anderson培养基,但在WPM培养基中的萌发速度快,萌发率也比较高。综合以上数据可以看出,大多数杂交组合的杂交胚在WPM培养基中萌发较好,且整体生长状态较好(图1,培养80d后所拍照片),其次是在MS培养中,适宜的组合数仅次于WPM培养基。因此以下实验都以WPM为基本培养基。2.2不同基因型的杂交胚萌发情况以映山红A为母本的12个杂交组合中,有4个杂交组合的杂交胚萌发,萌发率差异显著,映山红×马缨花杂交胚的萌发率最高,其次是映山红自交胚,映山红×腺果杜鹃和映山红×基毛杜鹃较低,其中映山红×基毛杜鹃的杂交胚的萌发率仅有0.7%(表2);以映山红B为母本的11个杂交组合中,有9个杂交组合的杂交胚萌发,仅映山红×云锦杜鹃、映山红×大白花杜鹃1这2个杂交组合的杂交胚未萌发,其中自交胚的萌发率最高;以映山红C为母本的3个杂交组合中,有2个杂交组合的杂交胚萌发。由此可以看出不同基因型的杂交胚,组培后萌发力存在显著差异。同时结果也显示以映山红B为母本的杂交组合,其杂交胚的萌发率整体偏高。映山红A和映山红B与浙江云锦杂交胚的萌发率为0和56.7%;映山红A和映山红B与薄皮杜鹃杂交胚的萌发率为0和68.8%;映山红A和映山红B与睫毛杜鹃杂交胚的萌发率为0和34.8%;映山红A和映山红C与碟花杜鹃杂交胚的萌发率为0和39.5%;映山红A和映山红C与基毛杜鹃杂交胚的萌发率为0.7%和18.2%。由此可以看出,不同植株的母本与同一父本花粉杂交后,杂交胚的萌发率也存在显著差异。映山红B与云锦杜鹃(浙江)和云锦杜鹃(云南)杂交胚的萌发率分别为56.7%和0,来源于不同地方的同一种父本与同一个母株杂交,幼胚之间的萌发率也有差异。马银花A和B母本仅与露珠杜鹃和红花锦绣杜鹃的杂交胚仅有2.0%和2.1%的萌发率,因此,马银花杜鹃和其他基因型杂交的胚拯救还是比较困难的。各杂交组合的杂交胚萌发后都部分形成愈伤,部分长成幼苗,不同杂交组合,愈伤与幼苗所占的比例都有所不同。2.3遗传因素对混合胚胎发芽的影响2.3.1两个杂交胚的萌发率部分杂交组合,如映山红×美容杜鹃等在2个月胚龄时进行了培养,但均没有萌发(数据未显示)。多数组合,如映山红A×滇南杜鹃、映山红A×马缨花、映山红A×浙江云锦、映山红A×大王杜鹃、映山红A×薄皮杜鹃、映山红A×满山红、映山红A×睫毛杜鹃这些杂交组合3个月胚龄和4个月胚龄的杂交胚培养时都有萌发。对这些组合的两个胚龄时期的萌发率进行方差分析,得到如下结果:映山红A×马缨花、映山红A×浙江云锦、映山红A×薄皮杜鹃这3个杂交组合3个月胚龄的杂交胚萌发率显著大于4个月胚龄的杂交胚;而映山红A×滇南杜鹃和映山红A×睫毛杜鹃这2个杂交组合4个月胚龄的杂交胚萌发率显著大于3月胚龄;映山红A×大王杜鹃和映山红A×满山红这两个杂交组合在两个胚龄时期的萌发率差异不显著(表3)。映山红×美容杜鹃、映山红×大白花杜鹃、马银花A×滇南杜鹃、马银花B×白花锦绣、马银花B×满山红等杂交组合3月胚龄的杂交胚也没有萌发,4个月胚龄的杂交胚培养时有萌发;映山红×基毛杜鹃的杂交胚,3个月胚龄培养时有萌发,但4月胚龄培养时没有萌发。映山红×云锦杜鹃这个杂交组合,授粉2个月、3个月、4个月后所取的杂交胚,培养后都没有萌发。2.3.2锦、映射山红a薄皮不同杂交胚的培养效果对3个月胚龄和4个月胚龄培养时都有萌发的杂交组合进行成苗途径(形成愈伤和直接成苗)的方差分析,结果表明,映山红A×马缨花、映山红A×滇南杜鹃、映山红A×浙江云锦、映山红A×大王杜鹃、映山红A×睫毛杜鹃这几种杂交组合3个月胚龄的杂交胚培养时,形成的愈伤比率显著大于4个月胚龄的杂交胚,形成幼苗的比率小于4个月胚龄的杂交胚;映山红A×薄皮杜鹃和映山红A×满山红这两个杂交组合3个月和4个月胚龄的杂交胚,培养后形成愈伤和幼苗的比率的差异不显著;只有映山红A×马缨花这1个杂交组合3月胚龄的杂交胚出苗率显著大于4个月胚龄的杂交胚。综上所述,胚龄对杜鹃杂交胚的成苗途径也有很大影响,对于大多数组合的杂交胚而言,幼龄胚更易形成愈伤,相对成熟的胚更易成苗。3杂交胚萌发规律对杜鹃杂交幼胚的拯救,WPM培养基是最广适的培养基,大多数杂交组合的杂交胚在WPM培养基中萌发较好,与EECKHAU在杜鹃杂交胚的组培中选用的培养基一致。其次是MS培养,适宜的组合数仅次于WPM培养基。URESHINO和MICHISHITA都选用的Anderson作为其杜鹃杂交胚的基本培养基,但在我们的试验中除了映山红×白花杜鹃这一杂交组合在改良的Anderson培养基上萌发率还比较好之外,其余杂交组合在这一培养基上的萌发率都不太理想。这表明不同杂交组合杂交胚的拯救,适宜的基本培养基类型也有所不同,但WPM培养基应该是杜鹃杂交胚拯救时,优先被选择的培养基类型。胚培养过程中胚的发育主要有3种方式:一是继续进行正常的胚胎发育,维持“胚性生长”;二是在培养后直接萌发成苗,称之为“早熟萌发”;三是先形成愈伤组织,并由此分化形成胚状体或芽原基。基因型、胚龄及激素等都会影响幼胚的成苗途径。本研究发现幼龄胚易于形成愈伤,较成熟的胚发育成幼苗的比率高。RANGAN认为植物幼胚拯救的成功率在很大程度上受基因型的影响,在亲缘关系比较近的栽培品种上差异也很大。一般杂交父母本基因型差异小,亲缘关系比较近的杂交组合亲和性好,杂交胚培养容易获得成功。本研究中同一亚属内的组间杂交,如映山红A×满山红的杂交胚萌发率高,也进一步证实了这一点。李辛雷等在菊属种间杂交胚拯救中,也发现亲缘关系较近,有利于子房直接萌发。不同母株与同一父本花粉杂交后,杂交胚萌发率也存在显著差异,这或许与母株的苗龄、营养状况等的差异有关。不同杂交胚败育的时间也不同,掌握不同杂交胚在胚败育之前最适宜的接种时期,将大大提高离体胚培养的效率。早期的杂交胚还处在异养时期,还没有达到可以萌发的水平,在外界离体培养时对营养的要求高;然而当杂交胚具备了萌发能力但又未发育完全时,这时早熟萌发也难以获得成功;发育后期时又会因为杂交胚的败育而失败。因此,确定合适的胚拯救时间也至关重要。本研究中因胚龄的不同,杂交胚的萌发力出现3种情况:(1)部分杂交组合,3个月胚龄的杂交胚萌发,但4个月胚龄的杂交胚没有萌发,或者3个月胚龄的杂交胚萌发率高于4个月胚龄的杂交胚。这种状况的出现,与孙晓梅、屈云慧等人认为的胚龄越大,胚胎离体培养越易成活的观点一致。刘小宁等也推测在杂交胚发育过程中,胚乳的中途退化使得胚在发育过程中缺乏营养,会导致其发育中止或败育;同时营养物与生长抑制物间平衡失调也可能胚败育。(2)个别组合,2,3,4个月胚龄的杂交胚均未萌发。其可能的原因之一:杂交胚已经在2个月胚龄前就败育了,一般而言,