第2章细胞工程高二生物必背知识清单（沪科选择性必修3）

第2章细胞工程一、利用植物细胞工程培育新植株细胞工程1.定义：以细胞生物学和分子生物学为基础，结合现代工程技术手段，在细胞或亚细胞水平、组织水平上进行设计与操作，是构建优良细胞、组织、器官以及生物体的综合性生物工程。2.分类：植物细胞工程：植物组织培养技术、植物细胞培养、植物体细胞杂交技术动物细胞工程：动物细胞培养技术、动物细胞融合技术、核移植技术、干细胞技术1.植物组织培养技术可将离体器官、组织或细胞再生为完整植株1、细胞的全能性①定义：离体的植物细胞在合适的条件下能够发育成为完整的植株。②物质基础：细胞中具有本生物的全套遗传信息。③表达条件：含有全套遗传信息的活细胞；处于离体状态；提供适宜的营养和环境条件。④全能性大小：分化程度越高，全能性越低植物组织培养①定义：将离体的植物细胞、组织或器官（外植体）在适宜的培养条件下经脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化，形成芽、根并最终发育成完整植株，这一过程称为植物组织培养。②原理：植物细胞的全能性③条件：离体、适宜的营养物质、植物激素、无菌、温度、湿度、光照、氧气。④相关概念脱分化在一定条件下，分化后的细胞重新获得类似于胚胎细胞一样的分裂和分化能力的过程。愈伤组织脱分化后的细胞经过细胞分裂，会形成无组织结构的、松散的细胞团。再分化愈伤组织在一定条件下可以重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整的植株。影响脱分化和再分化俩步骤的原因：多种内部因素和外部因素⑤过程：a.取材与消毒：取离体的植物器官、组织或细胞进行消毒b.接种：将外植体插入MS培养基中（不要倒插）。c.培养：外植体（记得消毒）↓脱分化愈伤组织↓再分化（需光，利于叶绿素合成）芽、根↓植物体d.移栽：先炼苗，再移栽。影响脱分化和再分化俩步骤的原因：多种内部因素（如植物遗传性状和生理状况等）和外部因素（如营养和环境条件等）生长素和细胞分裂素的浓度比对愈伤组织的生长和分化产生不同的影响。⑥植物激素的浓度控制：（使用顺序）生长素的浓度＞细胞分裂素，有利于诱导植物根的生成；生长素的浓度＜细胞分裂素，有利于诱导植物芽的生成；生长素的浓度≈细胞分裂素且都较高时，（外植体脱分化形成愈伤组织）有利于愈伤组织的形成。月季的快速繁殖1.选材与消毒选取枝条中具腋芽的月季嫩茎作为外植体。将外植体用自来水冲洗干净，分装到烧杯中，然后放在超净工作台上。加入75%酒精，预消毒0.5~1min；弃酒精，加入9%~10%的次氯酸钙，消毒10min；弃次氯酸钙溶液，加入无菌水清洗4~5次，用无菌滤纸吸尽多余水分备用。（防杂菌污染）2.接种将外植体剪成1~2cm带腋芽的茎段，用镊子夹取、插入MS培养基中（插入时应注意方向，不要倒插）。每瓶接种6~8块外植体。接种后，用封口膜重新将培养瓶封口。3.培养（1）诱导芽分化：待外植体长出腋芽后，将其转至芽分化培养基（MS培养基+2.0mg/L6BA+0.02mg/LNAA）,诱导芽分化，置于培养间培养（光周期12h光照∶12h黑暗，20℃，湿度85%以上）。每周更换培养基，约5~6周后，形成许多丛生芽。（2）诱导生根：将上述丛生芽接种于生根培养基（1/2MS培养基＋0.05mg/LNAA）上，置于培养间培养（培养条件同上）。每周更换培养基，约3周后长出数条根，形成幼苗。4.移栽幼苗出瓶前炼苗（即采取放风、降温、适当控水等措施对幼苗进行锻炼，先打开盖练一练）2~3天。出瓶后洗去黏附的培养基，栽植至营养土中，置于温度20℃、湿度85%以上、适当遮阴且通风的环境中种植，定期用0.1%的多菌灵喷雾保苗。3.植物组织培养的应用：①植物快速繁殖：将优良植株的茎尖或叶片等器官进行离体培养，在短时间内可以获得大量遗传性状一致的植株，这种技术称为植物快速繁殖技术。优点：a.因为是无性繁殖技术，可以保持优良品种的遗传特性。b.使用材料少（几个细胞就可以了），培养周期短，繁殖率高，便于自动化管理。②植物脱毒：利用植物组织培养技术还可以进行植物脱毒（即降低或去除病毒对植株的感染）。材料选取：植物顶端分生区附近（如茎尖）绝大多数的病毒是通过植物体内的维管组织（动物体内血管的作用）传播的，而位于种子植物胚珠中央的珠心组织与周围其他组织没有维管联系，因此通过珠心组织培养可以获得无毒植株。此外，通过离体培养分裂旺盛的茎尖也可以脱除植物病毒。③单倍体育种：将植物组织培养技术用于花药或花粉的离体培养，可以实现单倍体育种。过程：花药(或花粉)eq\o(――――→,\s\up7(离体培养))单倍体植株eq\o(――――――→,\s\up11(人工诱导),\s\do4(染色体加倍))纯合二倍体植株eq\o(――→,\s\up7(选择))优良品种。优点：明显缩短育种年限，后代稳定遗传，都是纯合体。④生产次生代谢产物（是一类细胞生命活动非必需的小分子有机化合物）：植物细胞除了能诱导形成完整植株外，还能像微生物一样在生物反应器里进行大规模的悬浮培养，用于生产重要的植物次生代谢产物。植物组织培养技术可以解决这一难题。通过对通过对红豆杉细胞的悬浮培养，可以从中分离出高纯度的紫杉醇。2.植物体细胞杂交技术可创造新植株植物体细胞杂交（植物原生质体融合，实质：细胞核的融合）：指将不同来源的植物细胞在一定条件下融合形成杂合细胞，并使之分化再生，最终形成新植物体的技术。（1）原理：细胞膜一定的流动性、植物细胞的全能性（2）意义：克服生殖隔离，产生新物种。（3）过程：=1\*GB3①原生质体的制备：去除细胞壁以制备原生质体（即去除了细胞壁的细胞）（动物细胞没有细胞壁，本身就是原生质体）。方法：机械分裂或酶解分离（纤维素酶和果胶酶）=2\*GB3②原生质体诱导融合的方法：物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG）③筛选和鉴定：由于诱导操作对于细胞融合没有选择性且融合效率并不高，因此，除了形成不同类型的融合细胞外，还会存在大量未融合的细胞，这就需要使用一系列的方法将发生了融合的杂合细胞筛选出来，并对其进行细胞学和生化分析鉴定。④植物体细胞杂交成功的标志：杂种细胞再生细胞壁补充：植物组织培养和植物细胞培养的比较比较项目植物组织培养植物细胞培养目的获得植物体获得细胞产物原理植物细胞的全能性细胞增殖过程应用快速繁殖、作物脱毒、单倍体育种等细胞产物的工厂化生产，如紫草宁、人参皂苷、紫杉醇等二、利用动物细胞工程改良动物细胞1.动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础植物是组织培养，而动物是细胞培养动物细胞培养：从动物体内取出组织或细胞（让它分散成单个细胞），在体外模拟体内的生理条件，使之得以生存和生长并维持其结构与功能的技术。（1）原理：细胞的增殖和生长（2）过程：动物组织（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）机械法、消化法单个细胞原代培养：首次细胞培养分离稀释传代培养4.细胞培养的结果：是细胞，而不是个体在培养过程中，动物细胞非常容易受到各种微生物的污染，因此，必须要在严格无菌的环境下进行细胞培养，并在培养液中加入一定量的抗生素）以防污染。同时，动物细胞培养对适宜的外界环境设定和维持也有严苛的要求。5.动物细胞培养的条件：必需的营养物质、无菌（加一定量的抗生素）、适宜的温度（如哺乳动物细胞和禽类细胞的适宜温度为±0.5℃）、pH（7.2～）是、控制培养液渗透压、95%空气和5%CO2(保持培养液pH的稳定)混合气体(既维持合适的溶解氧（溶解氧的水平会直接影响细胞的生长和代谢），又维持培养液中pH值的稳定)、定期更换培养液（及时清除代谢产物）。6.植物组织培养与动物细胞培养的比较植物组织培养动物细胞培养原理细胞全能性细胞增殖和生长培养基物理状态固体培养基液体培养基培养结果植物体细胞培养目的快速繁殖、培育无病毒植株等获得细胞或细胞产物过程外植体↓脱分化愈伤组织↓再分化芽、根或胚状体↓生长发育植物体动物的组织↓机械法或酶单个细胞↓原代培养↓传代培养相同点①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂；②均需要无菌操作、无菌培养，需要适宜的温度、pH等条件2.动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术受精过程是生殖细胞之间的自然融合。细胞融合（体细胞杂交）：在离体条件下，用人工方法将不同生物或同种生物不同类型的单细胞融合成一个杂合细胞。细胞融合技术可以使人们按照预先的设计使不同的细胞融合，创造出新的杂合细胞。融合方法：使两个甚至多个动物细胞融合形成一个细胞。①物理法：电融合（高压脉冲电场的作用下，细胞膜表面会形成大量微膜孔，进而发生细胞融合现象）；②化学法：PEG或其衍生物（具有比仙台病毒高数百倍的促细胞融合效率）；③生物法：灭活的病毒，如仙台病毒可以诱发细胞融合形成多核细胞。（2）原理：质膜的半流动性（3）结果：杂合细胞（4）用途：制备单克隆抗体制备单克隆抗体的原因：抗体是机体免疫应答的一个重要组成部分，可以特异性识别抗原。但绝大部分的抗原拥有多个不同的抗原决定簇（即抗原分子中决定抗原特异性并刺激B淋巴细胞分化为浆细胞的特定区域），会同时刺激多个不同的B淋巴细胞形成克隆群。所以，针对同一个抗原（多为蛋白质，是一个庞大的分子），机体往往会产生多种抗体。这样形成的抗体通常存在特异性不强、质量不稳定等问题，且经抗原激活后的B淋巴细胞也无法在体外长时间培养。①单克隆抗体：无限增殖的杂交瘤细胞，能持续分泌高度均一、仅针对某一特定抗原决定簇的抗体。②特点：高度特异性（灵敏度高，可以大量制备）③单克隆抗体制备过程：“4步曲”：对动物进行免疫→浆细胞（在促融剂的作用下）和骨髓瘤细胞融合→筛选选出抗体分泌阳性的杂交瘤细胞→克隆培养生产单克隆抗体绵羊红细胞作为抗原刺激小鼠脾脏的B淋巴细胞，获得了能产生抗体的浆细胞，后者在促融剂的作用下与小鼠骨髓瘤细胞发生融合，形成了杂交瘤细胞。通过选择培养基筛选出抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，并对其进行克隆培养。这样获得的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能持续分泌高度均一、仅针对某一特定抗原决定簇的抗体，即单克隆抗体。补充：项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后会得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和融合的具有同种核的细胞(“B—B”细胞、“瘤—瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B—瘤”细胞)才能生长用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞④应用：鉴定抗原以及疾病的诊断、治疗以及生理过程的检测具有重要价值。①利用单克隆抗体的靶向作用，可将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，将其携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，降低对健康组织与细胞的伤害（即靶向性治疗）。②早孕检测试纸可通过尿液快速检测出受孕妇女胎盘中产生的人绒毛膜促性腺激素。补充：植物体细胞杂交和动物细胞融合项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞增殖融合前处理除去细胞壁使细胞分散开相关酶纤维素酶和果胶酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶诱导方法物理法：电融合法、离心法；化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法物理法：电融合法；化学法：聚乙二醇(PEG)融合法；生物法：灭活病毒诱导法（动物病毒不能侵染植物的）结果杂种植株杂交细胞应用培育植物新品种主要用于制备单克隆抗体意义突破远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合相同点动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法相似3.细胞核移植技术是克隆动物的关键技术细胞核移植：将一种动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程。（1）方法：显微注射（将供体细胞的核移入去核的卵母细胞中，经过人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内，使其发育成为含有与供体细胞相同遗传物质的个体）（2）生殖方式：无性生殖（3）克隆：指分子、细胞或个体的无性繁殖系，如从一个分子复制成一组分子称为分子克隆；从一个细胞分裂生成一群细胞称为细胞克隆；动植物个体的无性繁殖就是个体克隆。（4）原理：动物体细胞核具有全能性（哺乳动物高度分化的体细胞核能够在卵母细胞细胞质的作用下恢复其全能性)克隆技术的应用：前景农牧业可将具有特殊期望性状的动物通过克隆产生更多的畜群科学研究基因完全相同的动物（同卵双生概率较低，可以通过克隆技术实现）可为有关实验提供最佳的“对照动物”制药行业人们正在尝试用克隆动物生产具有潜在医疗用途的产品野生物种保护可利用克隆技术繁殖濒危物种，为生态保护带来了无限希望问题①成功率非常低；②绝大多数克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷。补充：1.受体细胞为什么选用卵母细胞？体积大，易操作；去核时易于同时吸走第一极体；含有激发细胞核全能性的物质。2.为什么不是取供体细胞核进行核移植操作，而是将供体细胞整个注入去核卵母细胞中？保证供核不被破坏，使克隆动物更像供体动物，操作也方便。3.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的核遗传物质去掉或将其破坏。4.从多莉的产生过程可以看出多莉有三个亲本，探究多莉的性状表现与三个亲本的关系并分析原因。①大多数性状与母羊A(体细胞核供体)相同，因基因型与母羊A完全一样。②少数性状与母羊B(卵母细胞细胞质供体)相同，因细胞质中的基因来自母羊B，受质基因控制的性状与母羊B相同。③性状与母羊C(代孕母体)无关，因母羊C没有为新个体提供遗传物质。1.小克隆牛像谁？克隆动物的细胞质中遗传物质来自于卵母细胞并非供体细胞；生物性状的表达还受环境因素的影响。2.核移植技术与试管婴儿一样么?无性生殖，有性生殖3.该过程用到的技术手段?动物细胞培养、核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等4.细胞核移植技术是克隆动物的关键技术干细胞:具有自我更新和增殖、分化能力的细胞干细胞的分类：根据干细胞所处的发育阶段，可以把干细胞分成胚胎干细胞和成体干细胞。1.胚胎干细胞：高等动物受精卵发育成囊胚时的内细胞团，能在体外进行培养和传代，并在一定条件下保持分化的全能性，几乎可以分化出所有的细胞类型。.①胚胎干细胞的功能特点：能在体外进行培养和传代，并在一定条件下保持分化的全能性；能够分化出所有的细胞类型。②胚胎干细胞主要来源：囊胚的内细胞团或是胎儿的原始生殖细胞。前沿视窗：胚胎干细胞具有分化全能性，但其来源有限且涉及复杂的伦理问题；而各种成体干细胞（除造血干细胞外）的采集往往在技术上非常困难，且不具备分化成所有细胞类型的能力。2.成体干细胞：分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能的干细胞，在组织或系统的修复和再生中起着关键作用。按照分化潜能的大小，可以将成体干细胞分成两种类型。①多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的能力，但不具备发育成完整个体的能力，如骨髓多能造血干细胞，可以分化出多种不同的血细胞。②单能干细胞：只能分化成一种类型或密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞分化成肌肉中的成肌细胞等。3.诱导性多能干细胞（iPS细胞）：鉴于体细胞和干细胞拥有相同的遗传信息，目前可以通过多种以通过多种技术手段将体细胞诱导形成的具有与胚胎干细胞类似分裂和分化能力的干细胞。补充：治疗性克隆生殖性克隆：在哺乳动物的克隆过程中，克隆后代的进一步发育还需要将早期胚胎移植入一个代孕母体的子宫内，我们将这种类型的克隆称为生殖性克隆。治疗性克隆：目的不是产生一个活体生物，而是产生胚胎干细胞，并将其在合适的条件下（如某些生长刺激型蛋白质存在）分化成各种特化细胞乃至形成组织或器官。如果人们能找到正确的条件，便能培养胚胎干细胞用于修复受损或病变器官，如用来置换因脊髓损伤或心肌梗死所损坏的细胞。应用：1）治疗血液系统疾病；2）我国已经掌握了脐血干细胞分离、纯化、冷冻保存和复苏的全套技术，并在上海建立了我国第一个脐血库；3）将胰岛干细胞经体外诱导分化成产胰岛素的胰岛β细胞并移植给糖尿病小鼠，接受移植的小鼠血糖浓度控制良好，这为干细胞治疗糖尿病奠定了基础；4）在一定的药物诱导下，皮肤干细胞能使烧伤处的皮肤原位再生。三、利用胚胎工程快速繁育优良动物品种1.动物胚胎的形成经历受精及早期发育胚胎工程：对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体的技术。（1）操作对象：生殖细胞、受精卵以及早期胚胎细胞。（2）胚胎的早期发育过程：虽然高等动物的种类繁多，但是胚胎的早期发育有着相似的过程，分成受精、卵裂、桑椹胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。发育阶段发育特点受精由于卵黄的分布不对称，精子与卵结合之后形成的受精卵可以分为动物极（发育为外胚层）和植物极（发育为中胚层和内胚层）。（8细胞的时候不是上下均等分裂的，上面的得到的细胞质比较少，下面得到的细胞质比较多，上面就是动物极，下面大的就是植物极）卵裂期在卵裂阶段，受精卵先分裂成两个细胞（不均质分裂，两个细胞的胚胎，2细胞胚），之后细胞通常会逐次倍增，但胚胎的总体积大致不变。桑椹胚受精卵分裂成16~32个细胞的阶段，称为桑椹胚。（全能细胞，致密的细胞团）囊胚在这个阶段，动物极细胞的分裂频率会超越靠近植物极且含有较多卵黄的细胞群，形成中空的球状胚，称为囊胚。（内细胞团发育成胎儿的各种组织，滋养层细胞（贴着透明带的一圈细胞）将来发育成胎膜和胎盘）原肠胚随后形成的原肠胚具有外胚层、中胚层与内胚层，这三种胚层在之后会分化出各种组织和器官，逐渐发育成胚胎。2.胚胎工程快速繁育优良动物品种1.胚胎工程技术：体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植等体外受精：哺乳动物的精子和卵在人工控制的环境中完成受精过程的技术。受精：精子与卵子结合形成合子（受精卵）的过程场所：自然条件下，哺乳动物受精在受精卵内完成的。体外受精包括：卵的采集及成熟培养（（只能采集减二中的卵母细胞）在输卵管内进一步成熟，到MII（减二）期，才具备与精子受精的能力（后续经过精子的刺激才能进行后续的减数分裂，才能形成成熟的卵细胞，意味着没有刺激就停在减二中期