高效液相色谱-串联质谱法测定花生中的痕量挥发物

高效液相色谱-串联质谱法测定花生中的痕量挥发物

植物释放的许多废水有机物质（vocs）具有很高的化学活性。虽然某些蒸发信息化合物具有重要的相互作用，但植物、植物、环境和植物之间的相互作用是非常重要的。尤其是在植物的抗逆过程中。挥发性有机物是植物的次生代谢产物,植物通过释放VOCs表明身份,吸引传粉昆虫和植食性昆虫,还可通过改变VOCs的组成或释放量展示其生理状态及遭受的生存压力。植物受到危害后,还会释放吸引天敌昆虫的互益素。茉莉酸及其甲酯对植物的器官和细胞起着许多特殊的生理作用,且茉莉酸甲酯与水杨酸甲酯本身是植物体内一种重要的信号分子。因此,茉莉酸甲酯及水杨酸甲酯的检测也日益引起当今科技工作者的关注。目前,植物挥发物的提取方法主要有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超临界流体提取法、动态顶空采集法、固相微萃取等方法。较常用的固相微萃取虽然具有操作简便、经济高效等特点,但无法实现对挥发性物质的定量分析,且在分析活体植株时萃取过程会受到植物光合作用和呼吸作用所释放出的水蒸气和热量的影响。除动态吸附外,其它方法无法完成对活体植株挥发性成分的收集。另外,由于植物释放的VOCs通常是微量甚至痕量的,利用气相色谱质谱联用检测有时无法达到实验所需的灵敏度。因此,本文自行组装了动态吸附装置,利用高效液相色谱-串联质谱多反应监测模式(MRM)测定了花生植株中两种重要的痕量挥发性激素——茉莉酸甲酯与水杨酸甲酯,并采用内标法对茉莉酸甲酯及水杨酸甲酯进行了定量分析。1实验部分1.1试验仪器和装置Agilent1200型液相色谱(美国Agilent公司)、4000Q-Trap型质谱,配有三重四极杆/串联线性离子阱(美国AB公司)、MLR-351H型光照培养箱(日本Sanyo公司)、Milli-Q纯水器(美国Millipore公司)、5415D型离心机(德国Eppendorf公司)、KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、FM-120D型制冰机(日本Hoshizaki公司)、空气泵(美国Millipore公司)。Tenax-TA吸附剂购于上海安普科学仪器有限公司。茉莉酸甲酯及水杨酸甲酯标准品购于Sigma公司(纯度不低于99.5%)。内标二氢茉莉酮购于AlfaAesar公司(纯度不低于97%)。甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯,水为去离子水。标准品与内标的分子结构式见图1。实验所用动态吸附装置由活性炭管、吸附管、空气泵以及真空干燥器等依次组装,装置示意图见图2。空气泵开启后,气流经活性炭柱净化后进入装有植株的干燥器,植株产生的挥发物经干燥器另一端的吸附管吸附,流量计可控制气流的流量。真空干燥器可提供相对密闭的空间限制植物挥发物的扩散以提高其吸附量,同时避免外界空气污染物的影响。空气泵可以增加实验过程中的气体扰动和循环,使吸附成为一个循环和动态过程,同时增加吸附装置的吸附效率,使测定结果能够更加准确地反映植物挥发物质的组成。1.2水质条件色谱条件:色谱柱为C18(Agilent,2.1mm×150mm,5μm);进样量:10μL;柱温:30℃。流动相A为甲醇,B为0.05%甲酸溶液。梯度洗脱条件:0～2.0min,10%A;2.0～10.0min,10%～90%A;10.0～15.0min,90%A;15.0～15.1min,90%～10%A;15.1～22.1min,10%A;流速300μL/min。质谱条件:电喷雾离子源(ESI);正离子模式;雾化气(Gas1):413.7kPa;辅助气(Gas2):344.7kPa;气帘气(CUR):206.8kPa;离子喷雾电压(IS):5500V;电子能量70eV;离子化温度(TEM):500℃;检测方式:MRM。1.3混合溶液配制标准样品使用液:分别称取标准品适量,用甲醇稀释并定容,配成4mg/L的标准储备液,于4℃下密封保存备用。内标使用液:准确吸取一定量内标标准液,用甲醇稀释并定容,配成4mg/L的混合内标使用液,4℃下密封保存备用。混标使用液:准确吸取各使用液,用甲醇逐级稀释,配成1～1000μg/L的系列溶液。内标质量浓度均为50μg/L,-20℃密封保存备用。1.4采样管的充填Tenax-TA吸附剂使用前在270℃通氮活化2h。本实验以1mL玻璃试管为采样管,用镊子夹取洁净脱脂棉将采样管的一端堵住并形成约2～5mm的脱脂棉,再从另一端填充吸附材料,每支装填100mg的Tenax-TA吸附剂,然后再用脱脂棉将此端堵住约2～5mm。脱脂棉和吸附材料的填充紧度要适中,不要太紧密。1.5花生吸附处理花生种经浸水催芽后,每个品种挑选大小及发芽长度一致的种粒30粒转入Hogland营养液中,放入光照培养箱内培育。在花生6叶期,从上向下在第二、三叶顶端两片小叶1/4处剪切叶片,每蘸1次菌液剪2片叶,对照蘸取蒸馏水做同样处理。处理不同时间后,分别放入动态吸附装置干燥皿中,加入50μg/L内标液0.5mL,保持流速200mL/min,持续吸附2h。将吸附管取下,用3mL0.1%甲酸-甲醇溶液洗脱,收集洗脱液后冰浴氮吹浓缩至0.5mL,离心后进样检测。2结果与讨论2.1梯度洗脱条件优化考察了等度洗脱与梯度洗脱的效果。结果发现,梯度洗脱比等度洗脱的分离效果好。在梯度洗脱前期,有机相比例不能太高,否则水杨酸甲酯与内标物的出峰时间过于接近,不能实现良好分离,影响定性。优化的梯度洗脱条件见“1.2”。分别添加0.01%、0.05%、0.1%的甲酸控制流动相pH值,发现采用0.05%甲酸能使峰形尖锐,对称性好,3种分析物的典型色谱图见图3。2.2质谱条件确定采用针泵连续进样方式将标准物质注入质谱,优化ESI离子源MRM分析方法的质谱参数。先利用Q1全扫描确定母离子m/z值,然后采用碎片离子扫描选出信号值最高的子离子,依次优化每对离子的DP、CE及CXP值。3种分析物的相关参数见表1。2.3洗脱溶剂的选择考察了乙腈、甲醇、0.1%甲酸-甲醇3种洗脱剂对吸附剂的洗脱效果。结果表明,0.1%甲酸-甲醇的洗脱能力强于乙腈及甲醇溶液,因此本方法采用0.1%甲酸-甲醇为洗脱溶剂。实验考察了洗脱溶剂用量的影响,发现3mL0.1%甲酸-甲醇溶液可完全洗脱目标化合物。2.4标准曲线、检出限及定量下限将混标液用甲醇稀释,得到一系列浓度的溶液。取各浓度混标液0.5mL,加入到干燥器中,持续吸附2h,按样品处理过程解吸浓缩后上样检测,以待测物与内标的峰面积比(Y)对相应的质量浓度(X,μg·L-1)绘制标准曲线。在空白样品中添加2.0μg/L的茉莉酸甲酯标准溶液,经测定信噪比(S/N)大于3,表明茉莉酸甲酯的检出限为2.0μg/L。添加水平为5.0μg/L时信噪比(S/N)大于10,表明方法的定量下限为5.0μg/L。同法得到水杨酸甲酯的检出限及定量下限。该方法具有较宽的线性范围和良好的线性,能够满足植株痕量挥发性激素的检测要求,结果见表2。在干燥器中加入一定体积的混标溶液,采用动态吸附装置重复吸附3次,收集检测后计算得茉莉酸甲酯与水杨酸甲酯的相对标准偏差分别为7.1%和6.1%(结果见表3)。2.5青枯菌对不同植株释放水杨酸甲酯的影响按照实验方法考察了花生品种“远杂9102”处理及对照样品在0、3、6、9、12、24、48h时间段内茉莉酸甲酯及水杨酸甲酯单位时间释放量的变化情况,结果如图4所示。从图4可以看出,花生植株经青枯菌处理后,茉莉酸甲酯的释放量在6h时达最大值;水杨酸甲酯的释放量则表现出降低后增加的趋势,而且处理植株在0～6h以及48h时间段内的释放量均高于对照植株。而在对照植株中,茉莉酸甲酯与水杨酸甲酯的释放量在9、24h有明显的增加过程,