植物抗害虫的间接防御萜类化合物在植物间接防御中的作用

植物抗害虫的间接防御萜类化合物在植物间接防御中的作用

害虫和疾病是影响植物生长发育的重要因素。对于虫害,人们在很长一段时间内认为,植物采取分泌各种毒素、阻食剂的方法来抵御虫害,如蛋白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂、植物凝集素和几丁质酶等。其他来源的抗虫物质,如来自微生物的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白、营养期杀虫蛋白、异戊烯转移酶等和来自动物的昆虫毒素、咽侧体静体激素等都是直接作用于害虫的“直接防御”方式。十多年前荷兰和美国的学者首次发现某些植物在受到虫害后会释放有机挥发化合物以吸引天敌,此后人们对植物防御虫害的模式有了新的认识。这种吸引天敌来消灭害虫的“间接防御”已在多种植物中发现,被有机挥发化合物吸引的天敌以捕食和寄生两种方法消灭害虫。这些有机挥发物中以萜类居多,因此人们把目光聚集于这一类尚未完全了解的次生代谢物上。1昆虫和其他类化合物产生的因素昆虫危害是诱发萜类物质的主要因素,外源施加的茉莉酸和茉莉酸甲酯也能引起萜类物质的释放,而且不同植物可能由不同的因素诱导。1.1特殊的有机溶剂最初研究者认为,植物发动“间接防御”是由昆虫咬食造成的机械损伤所引起,然而随着研究的深入,发现昆虫口腔内的分泌物在诱发“间接防御”中发挥了关键性作用,这些来自昆虫口腔的分泌物主要是脂肪酸–氨基酸轭合物、脂肪酸、酶和多肽类的物质。最早在甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)幼虫口腔分泌物中分离的化合物N-(17-羟基-亚麻酰基)-L-谷氨酰胺[N-(17-hydroxylinolenoyl)-L-glutamine,简称volicitin],能诱导受到机械损伤的玉米幼苗释放芳樟醇、(E)-β-法尼烯、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、(E)-橙花叔醇、吲哚等挥发性化合物,吸引寄生蜂。在南美沙漠蝗中发现的caeliferins是一类非鳞翅目激发子,它们是含有15～20碳的脂肪酸,其中16碳的同型物最能诱导挥发物的释放,当玉米幼苗用5μlcaeliferins处理后,其效果与用100pmol的volicitin处理和害虫咬食2h基本相同,可以诱发吲哚、单萜、倍半萜以及它们11碳和16碳的同系物。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)除了具有纤维素的糖化作用外,还与萜烯类化合物挥发有密切联系。菜粉蝶(Pierisbrassicae)幼虫口腔分泌物中的β-葡萄糖苷酶可直接作用于糖苷上,诱导甘蓝萜类挥发物的释放,成为激发萜类物质产生的激发子。N-酰氨酸广泛存在于昆虫口腔分泌物中,作为取食的表面活化剂,由昆虫肠道内的一系列微生物合成,Spiteller等从甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)和地老虎(Agrotissegetum)的口腔分泌液中鉴定出10种菌株,它们能把不同长度、饱和度的脂肪酸合成典型的鳞翅目N-酰氨酸。最近在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)口腔分泌液中发现的inceptin,来自于叶绿体ATP合成酶亚基γ-亚基的调节区域,能引起植物释放乙烯、水杨酸和茉莉酸。1.2br多态性激发子植物群落松叶蜂(Diprionpini)的输卵管分泌物可以诱发萜类物质释放,但具体的激发子是什么目前还不清楚。有意思的是,从两种豆象(Bruchuspisorum和Callosobruchusmaculates)产卵液中鉴定的激发子Bruchins,包括豆象素B、C和D,它们可以在很低的浓度(1fmol)下刺激鳌生性组织在未受损的菜豆叶中形成,抬高卵的位置,延长初孵幼虫进入菜豆的时间,使卵更长时间暴露在天敌和干燥的环境中。1.3植株侵害率测定单纯的物理损伤或没有被害虫侵害的植株一般不产生或只产生少量的萜类物质,在其它的一些三级体系(植物—昆虫—天敌)中,未受害的植株上空也发现了萜类物质,但其含量明显少于被侵害的植株。当在物理损伤处施加昆虫口腔分泌物、输卵管分泌物或茉莉酸等物质时,挥发物的组成和含量才会有明显的变化,而Mithofer等采用“机械昆虫”模仿海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)对利马豆(Phaseoluslunatus)咬食所产生的损伤(包括物理形态和持续时间),可诱发相似组分但某些组分含量不同的挥发物,损伤水平与脂肪酸来源的挥发物、单萜呈线性关系,但与其他萜类、甲基水杨酸不呈线性关系,他们认为物理损伤的作用受到低估。1.4ja和meha对植物抗虫的诱导茉莉酸(Jasmonicacid,JA)及其衍生物是一类可以激活一系列植物抗虫防卫反应的重要内源信号分子,当植物受到机械伤害和病虫危害时,体内茉莉酸和茉莉酸甲酯(Methyljasmonate,MeJA)会迅速积累,而且外源施加的JA和MeJA也可以诱导植物抗虫反应。它们主要通过两种途径诱导防御反应,一是与受体、细胞膜结合后,经由硬脂酸途径合成JA、MeJA,激活防御基因,二是与受体、细胞膜结合后直接激活防御基因。一般说来,JA在中等浓度时活性较高,据报道,1nmol/L的JA和1μmol/L的MeJA就能诱导植物基因表达水平的变化。2激活类合成酶基因,激活类合成酶基因植物受到虫害后,接收体外的诱导信号,在体内传递并放大,通过激活萜类合成酶基因合成萜类合成酶,从而促进萜类的合成并释放。这些过程受到一系列复杂和精细的调控。2.1ja植物的外源信号分子对于外源信号是如何在植物体内接收的研究相对较少,目前只有关于volicitin结合蛋白的报道,该结合蛋白存在于质膜上,与volicitin的结合具有高度亲和性、饱和性和可逆性,可以特异性地区分L-/D-volicitin对映体,而且MeJA处理植物后可提高其结合能力。外源信号接收后可通过膜电位或者植物体内的其他内源信号分子传递。植物被害虫取食后,在取食部位立即产生一个动作电位,这个动作电位能在短时间内传遍整个植株,引起膜电位变化,随后胞内的Ca2+浓度增加,蛋白激酶被激活,并产生与防御反应有关的植物激素,最后由多种信号传导途径及其相互作用调控被害植株的系统防御反应。植物体内的内源信号分子包括系统素(systemin)、十八烷酸(ODA)、12-氧合植物二酸(12-OPDA)、茉莉酸、茉莉酸甲酯等。系统素能在植株损伤部位通过激活茉莉酸信号途径来合成能够长距离传递的信号分子(如JA或OPDA),这些可移动的分子在植物的未受害部位被相应的膜受体所识别,随后通过一系列信号转导过程,诱导植株系统性地产生并释放具有防御功能的化学物质。2.2裸子植物群落的类合成酶基因萜类是植物次生代谢物中最为丰富的一类,对萜类合成酶及其编码基因的研究也很多,如表1,在裸子植物(挪威云杉)和被子植物中都有发现萜类合成酶,被子植物中的单子叶植物(水稻、玉米)和双子叶植物中也都鉴定出相应的萜类合成酶及其基因,表达的部位以叶居多,也有在花和根中表达,产物主要是挥发性的单萜和倍半萜。萜类合成酶拥有共同的进化起源,根据其氨基酸序列的关系可以把其基因分为7个亚家族(TPSa到TPSg),其中TPSc、TPSe、TPSf与初级代谢相关,而TPSa、TPSb、TPSd与次级代谢相关。与次级代谢相关的酶占了萜类合成酶的大多数,被子植物中TPSa、TPSb居多,而裸子植物萜类合成酶独成一支TPSd。萜类合成酶约含有550～850个氨基酸,分子量为50～100kDa,总的来说,单萜合成酶长度为600～650个氨基酸,比倍半萜长50～70个氨基酸,因为单萜合成酶包含一个质体定位的信号肽,多数双萜合成酶比单萜合成酶还要长210个氨基酸的长度,因为其中存在一段保守序列,据推测该序列可能与环化相关,具体机理尚不清楚。几乎所有的酶都有富含天冬氨酸的DDxxD序列,此序列和二价金属离子共同作用以结合底物。2.3ipp和dmac合成类植物萜类化合物的合成有两条途径,一是存在于胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径,由乙酰辅酶A缩合生成合成前体物质异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲丙烯二磷酸(DMAPP),接着在FDP合成酶催化下生成法尼基二磷酸(FDP),最后合成倍半萜和三萜;二是存在于质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径,由丙酮酸和三磷酸甘油醛生成IPP和DMAPP,进一步合成牦牛儿二磷酸(GDP)、牦牛儿牦牛儿二磷酸(GGDP),最后产生单萜和双萜。虽然在不同的亚细胞结构内合成,萜类的合成一般为以下模式:合成IPP和DMAPP→合成萜类骨架前体(FDP、GDP和GGDP)→合成萜类骨架→产物的修饰。在合成IPP和DMAPP的过程中,胞质和质体中的前体物质存在联系,当其中一条合成途径受到阻碍时,另外一条合成途径将会起到补偿作用,一些植物中的IPP和DMAPP都由MEP途径合成,合成的IPP和DMAPP从质体流到胞质方向。萜类物质主要从叶、根等的表皮细胞或分泌腺中释放出来,一般情况下,萜类物质的释放具有滞后性。损伤的早期主要释放大量的脂肪氧合酶衍生的挥发性化合物,随着为害的继续,早期阶段释放得很少的其它一些萜类物质开始增多,主要有(E)-罗勒烯、芳樟醇、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、(E)-法尼烯、(E,E)-法尼烯等。2.4非生物环境因子由于不同害虫的口器、取食方式不同,植物会做出不同的反应;而对于同一种害虫来说,不同的龄期、密度造成的危害程度不同也会使得相应萜类物质的释放有所不同,如1龄期到4龄期粘虫(Pseudaletiaseparata)的幼虫诱导玉米产生的挥发性物质能引诱寄生蜂,而被5龄期和6龄期幼虫侵害的玉米却不能吸引害虫天敌;在利马豆和黄瓜为材料的实验中,天敌更易被多害虫侵害的植株吸引,表明单一虫害和多重虫害会引起植物不同程度的响应。植物的种类、品系、发育阶段、受害部位、程度、持续时间等一系列因素也会影响后续萜类种类和含量的变化。玉米不同品种B73和Delprim会释放出成分相同但含量不同的挥发性物质,因为在这两个品种中虽然都有基因tps4和tps5的位点,但B73中的tps4有功能tps5无功能,而Delprim的情况正好与之相反。除了生物因素外,萜类的合成也受到非生物因素的影响。Gouinguene等的研究表明在干燥的土壤中,玉米幼苗相对释放出更多的挥发物,最佳相对湿度为60%,最佳温度为22～27℃;在黑暗中几乎没有挥发物的释放,随着光强的增加挥发物增加;施肥也是一个关键因素,当营养缺乏时,释放量会减少到最低。虽然在很多植物中已经鉴定出萜类合成酶及其基因,但植物体内接收外界各种信号的受体和信号传导途径,以及这些过程中所涉及到的启动子、转录因子和转录、翻译后调控还不是特别清楚。目前已有报道的转录因子有ORCA3和GaWRKY1,ORCA3是长春花(Catharanthusroseus)中响应JA的APETALA2(AP2)-结构域转录因子,过表达ORCA3能够提高生物代谢途中相关基因的表达水平,增加萜烯类吲哚生物碱的积累;在棉花(Gossypiumarboreum)中发现的GaWRKY1能够调节δ-杜松烯合成酶(CAD1-A)的合成,在拟南芥中过表达GaWRKY1可以极大激活CAD1-A启动子活性[WRKY转录因子是近年来在植物中发现的N端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子,它能够与(T)TGAC(C/T)序列即w-box发生特异性作用,调节启动子中含有w-box元件的调节基因或/和功能基因的表达,从而参与植物的各种防卫反应];另外,灰白杨(Populu×canescens[Aiton]Sm.)叶片中异戊二烯合成酶(PcISPS)的蛋白密度和酶活在夏末到达最高,PcISPS转录最高水平出现在初夏,秋季时蛋白水平不变而酶活下降,表明其酶活受到翻译后调控,而且与其底物DMAPP水平密切相关。然而萜类合成与释放的调控是一个极其复杂的网络调控过程,目前人们所知道的只不过是其中很小的一部分,还有大量的研究工作需要进行。3类化合物相关的基因检测害虫天敌会顺着植物释放的一系列萜类物质找到它们的猎物或寄主,从而消灭害虫,避免植物受到进一步伤害。Wei等利用气相色谱-触角电位仪(gaschromatography-electroantennographicdetection,GC-EAD)发现,四季豆(Phaseolusvulgaris)受到2龄南美斑潜蝇(Liriomyzahuidobrensis)或美洲斑潜蝇(Liriomyzasativae)危害后,释放的(3E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯,(3Z)-己烯醋酸盐以及肟类化合物可明显引起天敌离斑斑潜蝇茧蜂(Opiusdissitus)的触角电图反应,因此萜类、肟和绿叶气体的混合物可能可以帮助天敌寻找到它们的目标。单一萜类或者几种萜类的混合物可以吸引天敌,萜类与其他某些物质的混合物对天敌也有吸引作用,但混合物中各个物质的具体作用机理还不是特别清楚。利用基因工程手段转入外源萜类合成酶基因调控萜类化合物的合成,可以达到间接防御害虫的目的。转入草莓芳樟醇/橙花叔醇合成酶FaNES1基因的拟南芥会释放出4,8-二甲基-1,3(E),7-壬三烯和(3S)-(E)-橙花叔醇,通过Y-试管嗅觉测量计(olfactometerassay)检测到害虫天敌智利小植绥螨(Phytoseiuluspersimilis)会选择转基因的拟南芥植株;Schnee等在研究中采用六臂嗅觉测量计,其中一臂的一端放置转入玉米萜类合成酶tps10基因的拟南芥[释放(E)-β-法尼烯、(E)-α-佛手柑油烯等],正对的另一臂放置野生拟南芥,其他四臂注入空气,结果表明寄生蜂(C.marginiventris)绝大多数会选择转基因的拟南芥。研究证明,通过转基因方法可以有效的提高植物的间接防御水平,通过间接防御水平的提高并与直接防御相结合是一种新型的全方位的害虫防御策略。4对害虫的间接防御植物受到害虫危害后会释放以单萜和倍半萜为主的萜类化合物来吸引害虫天敌,以达到消灭害虫,避免进一步伤害的目的,这种“间接防御”的方法能够为植物保护提供一个新颖且环保的思路。植物虫害防治大多采用直接防御的办法,目前研究