富血小板血浆的浓度测定及分析

富血小板血浆的浓度测定及分析

自20世纪90年代出版自强化血浆（prp）技术以来，科学家们对其制造技术和设备进行了大量研究，并取得了显著的成果。目前,美国FDA认证并商业化生产的PRP制备系统有9种,其中部分制备系统能快速稳定地获得PRP,但获得的PRP在血小板回收率及浓度方面存在较大差异,如Sequire系统血小板回收率仅为31%±15%,AutoloGel和Sequire系统制备的PRP血小板浓度分别是生理浓度的1倍和1.6倍,均未达到PRP发挥作用的“治疗浓度”。此外,这些PRP制备系统价格较昂贵,不利于PRP技术在临床的广泛应用。在国内,虽然目前PRP已应用于骨科、整形外科、口腔外科等多个领域,但尚无专业的PRP制备系统,多采用开放式二次离心法制备,存在PRP易受外界污染、血小板回收率相对较低、易受操作因素影响、制备方法不稳定等缺点。山东威高集团医用高分子制品股份有限公司根据PRP在临床应用的特点设计开发了一套PRP制备套装,该套装已通过了国家食品药品监督管理局的认证。本实验通过分析采用此套装获得的PRP中血小板、白细胞和生长因子的浓度,计算相关回收率和富集系数,并进行相关性分析,以检验此套装的实用性和稳定性,从而为其临床应用提供实验依据。1材料和方法1.1纳入和排除标准取30例成年健康自愿者捐献的外周血,男女各15例;年龄24~76岁,平均47岁。自愿者纳入标准:①符合《中华人民共和国献血法》和卫生部颁布的《献血体格检查标准》,血红蛋白>11g/L,血小板>1.5×109/L。②采血前5d内未服用影响血小板功能和凝血系统的药物。③无传染性疾病、相关血液疾病、严重心血管疾病及感染。1.2试剂、仪器和仪器枸橼酸钠注射液(天津金耀氨基酸有限公司);凝血酶冻干粉(常州千红生化制药股份有限公司);氯化钙注射液(上海信谊金朱药业有限公司);PDGF、TGF-β、VEGFELISA试剂盒(R&DSystems公司,美国)。PRP制备套装(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司);TDL-5台式多管架悬摆离心机(上海安亭科学仪器厂);KX-21全自动血液分析仪(SYSMEX公司,日本);酶标仪(ThermoScientific公司,美国)。1.3prp的制备用预先装有5mL枸橼酸钠注射液的50mL一次性注射器以18G针头于每例志愿者肘前静脉取血40mL。摇匀后,取1mL作血细胞分析,4mL作生长因子浓度测定;剩余40mL注入PRP制备套装离心管中,于严格无菌状态下制备PRP。根据血液中各组分的沉降系数不同,以离心半径15cm、2000r/min离心10min后,全血分为3层,上层为上清液,下层为红细胞,两层交界处一浅黄色层即PRP层。打开离心管最左侧通气孔,20mL注射器连接离心管中间吸管孔,吸取下层红细胞约16mL。将剩余血液同上法离心后,可见在底部红细胞表面有白膜样物质,即为血小板和白细胞沉积层;其上部为透明的血浆层。再次打开通气孔,20mL注射器连接无菌吸引管,经离心管右侧吸引孔吸取上部大部分血浆,保留离心管中约4mL血浆。静置片刻后振荡离心管约5min,使血小板充分重悬于剩余血浆中,即得到PRP。1.4测试指标1.4.1回收率及富集系数测定分别将1mL抗凝静脉血和制备的PRP采用全自动血液分析仪进行血常规分析,测定血小板及白细胞浓度,并计算PRP中血小板和白细胞浓度变异系数。计算PRP中血小板或白细胞回收率和富集系数,回收率=PRP中血小板或白细胞总数/全血中血小板或白细胞总数×100%,富集系数=PRP中血小板或白细胞浓度/全血中血小板或白细胞浓度。分别测定男、女自愿者PRP血小板及白细胞浓度。1.4.2生长因子的制备于4mL抗凝静脉血中加入0.4mL凝血酶和氯化钙混合物(2000U凝血酶中加入5mL5%氯化钙溶液),3min后血液凝聚成冻胶状,常温下静置1h后,同上法离心10min,吸取上清液转移到冻存管中。将制备的PRP采用相同方法制备得到富含生长因子的上清液。取制备的全血及PRP上清液,按照ELISA试剂盒说明测定PDGF、TGF-β及VEGF浓度。1.5血小板及联合用药的相关分析采用SPSS17.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,对全血和PRP中血小板和白细胞浓度、PRP中血小板和白细胞的回收率和富集系数、PRP中生长因子浓度采用Pearson检验进行相关分析;全血和PRP中血小板及白细胞浓度比较、男女组间血小板和白细胞浓度比较采用t检验;检验水准α=0.05。2结果2.1prp检测血小板回收率和富集系数全血和PRP中血小板浓度分别为(131.40±29.44)×109/L和(819.47±136.32)×109/L,比较差异有统计学意义(t=—27.020,P=0.000);PRP中血小板回收率为60.85%±8.97%,富集系数为6.40±1.06。全血和PRP中白细胞浓度分别为(5.57±1.91)×1012/L和(32.20±10.42)×1012/L,比较差异有统计学意义(t=—13.780,P=0.000);PRP中白细胞回收率为58.30%±19.24%,富集系数为6.10±1.93。PRP中血小板浓度和白细胞浓度分别与全血中血小板浓度(r=0.652,P=0.000)和白细胞浓度(r=0.460,P=0.011)成正相关。PRP中血小板(r=0.743,P=0.000)和白细胞(r=0.945,P=0.000)的回收率和富集系数间成正相关。另外,分析PRP回收率和富集系数数据显示均为正态分布(P值分别为0.671和0.706),且标准差分别为1.06和8.97。PRP中血小板和白细胞的浓度变异系数分别为16.64%和32.36%。男性组和女性组PRP中血小板浓度分别为(792.07±161.05)×109/L和(846.87±104.63)×109/L,比较差异无统计学意义(t=—1.110,P=0.279);两组PRP中白细胞浓度分别为(29.91±10.13)×1012/L和(34.5±10.53)×1012/L,比较差异无统计学意义(t=—1.220,P=0.234)。2.2全血评分gc/ml全血中PDGF、TGF-β、VEGF浓度分别为(126.10±7.89)、(100.14±10.53)、(185.58±16.83)ng/mL;PRP中分别为(698.15±64.48)、(681.36±65.90)、(1071.55±106.04)ng/mL,是全血的(5.67±1.18)、(6.99±0.61)、(5.74±0.83)倍。PRP中PDGF浓度(r=0.832,P=0.020)、TGF-β浓度(r=0.835,P=0.019)、VEGF浓度(r=0.824,P=0.023)均与PRP中血小板浓度成正相关。3讨论3.1影响因素分析3.1.1中小型血小板患者受外源性刺激而被激活的影响PRP的血小板计数在一定程度上影响了实验结论的客观性和可比性,但血小板计数受很多因素的影响,包括体内和体外两方面。在体内,除受多种药物影响外,血小板本身还存在生理性波动,不同年龄、不同季节、一天中不同时间的血小板浓度呈规律性变化;此外,从不同部位、不同体位或运动前后取血进行检测,血小板计数也呈显著性差异。在体外,血小板易受外源性刺激而被破坏或者激活,如动作粗暴、抽血时间过长、针头过小、止血带运用不当、不适当的抗凝剂和储血器、摇匀程度、放置时间等均会人为造成血小板活化和破坏,影响计数。Woodell-May等发现,PRP血小板计数与震荡时间有关,他们建议PRP在振荡器上振荡应不少于5min才可能得到较准确的血小板计数。本实验为保证样本的同质性,所有抽血、离心和血细胞计数分析均由同一组医务人员进行,全程操作轻柔;尽量让自愿者在相同状态下快速顺利一次性取血;计数前充分震荡混匀PRP;所有样本均在采血后1h内检测完。但我们认为本实验中仍存在影响实验结果的可能因素,比如第1次离心后吸取底层红细胞的量是通过注射器刻度和个人经验来判断,存在一定误差,直接影响了第2次离心后剩余PRP的量,因为增加抽取的血液量和减少第1次离心后底层红细胞量,均会增加PRP中血小板和白细胞浓度。此外,考虑到部分自愿者年龄偏大,静脉穿刺较难,有10名自愿者在止血带帮助下抽取静脉血,这也可能造成PRP批内差异较大。3.1.2离心次数和离心稳定性对血小板浓度的影响目前已上市的PRP制备系统设计原理基本相同,但不同研究结果仍存在较大差异,这可能与实际操作时的不稳定因素有关,比如离心力和离心时间的选择,离心管的管径、长度,操作者的熟练程度等。不同离心方法对应了不同的离心力和离心时间,其制备的PRP中血小板浓度和活性也各不相同。目前制备PRP的方法包括Anitua法、Petrungaro法、Landesberg法及Aghaloo法等,大多学者首选二次离心法。一般认为,PRP中的血小板在体外较脆弱且容易被激活,过高的离心速度会使血小板膜破裂,降低其生物活性,因此离心时速度不宜过快。Sonnleitner等发现第1次离心时采用160×g离心20min后,交界面以下6mm的血小板浓度最高;第2次离心以400×g离心15min后,试管底部血小板浓度超过2×107/uL,约达正常血小板浓度的10倍。Marx则认为离心力(g)与离心时间(min)的乘积超过11000g.min时,血小板将被大量破坏,造成生长因子流失。经比较研究证实,Landesberg法(两次离心均为200×g、离心10min)制备的PRP中血小板浓度高,活化率小。但也有学者认为采用第1次以200×g离心10min,第2次以1200×g离心10min的方法制备的PRP中血小板浓度和回收率高。我们在预实验时发现当抽血量低于20mL,离心力约为200×g时,用此套装可以制备出PRP,但按照本实验之前的设计,取血量为40mL时,则不能成功制备出PRP。分析原因可能有两方面:第一,取血量少时,对离心力要求低,但考虑到临床对PRP中血小板浓度的要求,必须有较大的离心血量,而较多的血量对离心力要求较高。第二,若离心试管直径小,则血液成分容易分层,所需离心力小。而该套装为了满足对血量的需求,离心管直径大,所以需要更大的离心力。因此,实验中我们以离心半径15cm、2000r/min离心10min的条件离心2次后成功制备PRP。本实验PRP富集系数和回收率均为正态分布(P值分别为0.671和0.706),且标准差分别为1.06和8.97,表明采用此套装可以较稳定地获得高浓度血小板。另外通过计算浓度变异系数来比较批内各次制备PRP中血小板和白细胞的浓度差异大小,也可在一定程度上反映出此套装制备PRP的稳定性。PRP中血小板和白细胞的浓度变异系数分别为16.64%和32.36%,可以认为PRP中制备得到的血小板较白细胞更稳定。3.1.3性别因素对prp的影响本实验中,PRP中血小板和白细胞浓度男女组间差异均无统计学意义,提示用此套装制备的PRP不受性别因素影响。但本组30例自愿者中有2例(分别为男73岁,女65岁)在第1次离心后出现溶血现象,我们认为可能与自愿者年龄偏大,红细胞脆性增加有关。3.1.4生长因子浓度与血小板浓度的关系由于PRP主要通过高浓度血小板释放出的生长因子来发挥其修复作用,因此理论上讲,生长因子的浓度应该与血小板浓度成正相关,但对此尚未达成共识。我们的实验测定的PRP中生长因子浓度与PRP中血小板浓度成正相关,这与多项研究结论相同。3.2非凝胶状态的富白领prp的应用由于制备方法和步骤有很大差异,目前将PRP大致分为两种:贫白细胞PRP(即只含有高浓度的血小板)和富白细胞PRP(含有高浓度的PRP和白细胞)。研究认为,富白细胞PRP相比贫白细胞PRP能更持久地释放生长因子和纤维胶原等成分,因此更适合应用于损伤组织修复和再生。随着对制备技术的不断研究,越来越多的设备能够制备出非凝胶状态的富白细胞PRP以满足临床应用。非凝胶状态的PRP因为可人为设定凝血酶或氯化钙的添加时间,适合于注射或者局部创面等运动医学领域;而凝胶状态PRP则很难进行注射等操作,但由于其良好的组织构架和强度,可用于口腔颌面外科。正是基于贫白细胞和富白细胞PRP各自的特点和本实验的设计目的,我们在全血中加入抗凝剂的同时,在第2次离心后提取白细胞和血小板。实验结果表明,应用此套装能成功提取出高浓度和高回收率的富白细胞PRP,白细胞回收率为58.30%±19.24%,白细胞富集系数为6.10±1.93。3.3血小板富集及回收率目前,美国FDA认证并商业化生产的9种PRP制备系统均对应着不同的制备技术,但制备PRP的基本方法均为离心法。9种系统平均制备时间为17.67min,平均血小板富集系数为4.24,平均血小板回收率为60.2%,制备套装的平均价格为533.89美元。其中AutoloGel系统用时最少,但其