uplc法测定炮姜中新生成分姜酮的含量

uplc法测定炮姜中新生成分姜酮的含量

干姜是姜科植物的一种干燥的根茎。姜是他加工的东西。干姜的作用是加热和回阳，生姜的作用是加热和止血。课题组前期研究表明,干姜在炮制为炮姜后,药性发生了“走”与“守”的转变,从而带来了其功效的变化,原因与炮制前后成分的“量”与“质”两方面变化均有关;目前已经证实,干姜在炮制成炮姜过程中产生了一种新的成分———姜酮(C11H14O3),该成分具有一定的抗菌、抗氧化和抗炎等药理作用。如何简便、高效提取炮姜中新生成分姜酮,对炮姜的质量控制和进一步开发研究十分关键。本实验以炮姜中新生成分姜酮的含量为评价指标,通过单因素考察和正交试验优选姜酮的提取方法和工艺,为进一步完善炮姜的质量控制方法及进一步开发提供理论依据。1文献1:吉首市中药质量鉴定组使用第20e超高效液相色谱仪(WatersAcquityH-ClassUPLC,美国Waters公司);超声仪(江苏昆山超声仪器有限公司);HFB—200型高速中药粉碎机(吉首市中州中药机械厂);干姜由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供,经韩燕全副主任中药师鉴定为姜科植物姜Zingiberofficinalies(Wild.)Rose.的干燥根茎,炮姜为课题组按照《中国药典》2010版(附录ⅡD)项下砂烫法,结合课题组前期优化的工艺炮制而得。对照品批号:姜酮(批号:122-485,纯度为98.51%)购于上海鼎瑞化工有限公司,经1H-NMR、13C-NMR、UV、IR和MS等光谱检测确认其结构;乙腈为色谱纯(美国SIGMA公司),屈臣氏牌蒸馏水;乙醇等试剂为分析纯。2方法和结果2.1姜醇含量测定2.1.1色谱柱及色谱线WatersAcquityH-ClassUP-LC超高效液相色谱仪,包括四元梯泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower2工作站(美国Waters公司);色谱柱为WatersAcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm);流动相为乙腈—水(A-B),梯度洗脱顺序为:(A-B:0~3min,25∶75;3~3.5min,100∶0;3.5~5min,100∶0;5~6min,25∶75;6~8min,25∶75)流速为0.30mL·min-1;检测波长:280nm;柱温:30℃,理论塔板数按姜酮峰计算应不低于6000,UPLC色谱图见图1。2.1.2对照品贮备液的制备精密称取姜酮对照品7.32mg,置10mL容量瓶中,加入甲醇溶解并稀释到刻度,摇匀,得浓度为0.732g·L-1的对照品贮备液,备用。2.1.3超声辅助制备分别取干姜和炮姜适量,粉碎后过40目筛,各取5g置50mL具塞锥形瓶中,加入90%乙醇至刻度,超声(150W,40Hz)30min,放冷,称量,加甲醇补足失质量,摇匀,0.22μm滤膜滤过,取续滤液,备用。2.1.4线性关系的考察分别精密吸取2.1.2项下姜酮对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μL,按2.1.1项下色谱条件进样,记录色谱图并测定峰面积,以对照品浓度(X)为横坐标,峰面积值(Y)为纵坐标,得回归方程为Y=2979560.0X-21580.2,r=0.9999,姜酮在0.0732~0.366μg范围内呈良好的线性关系。2.1.5准确度测量精密吸取2.1.2项下对照品溶液2μL,连续进样6次,记录色谱图,计算峰面积值的RSD为0.68%,说明仪器精密度良好。2.1.6进样稳定性试验精密吸取对照品溶液2μL,分别在1、2、4、8、16和24h进样,记录色谱图,计算峰面积的RSD为0.64%,表明样品在24h内稳定。2.1.8加样回收率试验取已知姜酮含量的炮姜样品粉末6份,精密称定,加入适量的姜酮对照品溶液,按2.1.3项下方法制备供试品溶液,按2.1.1项下色谱条件测定峰,计算平均回收率为98.60%,RSD为2.24%。2.2姜酮提取的单因素研究2.2.1姜酮含量测定在预试验基础上,选取水、甲醇和乙醇为提取溶媒,溶剂用量10倍,分别采用超声法提取30min,按2.1.2项下制备样品溶液测定,计算姜酮含量分别为0.449、0.780和0.770mg·g-1(n=2);考虑甲醇和乙醇作为溶剂的提取含量结果较接近,故选用乙醇作为溶剂作进一步考察。2.2.2乙醇浓度对姜酮含量的影响在溶剂考察基础上,分别选取20%、40%、60%、80%和95%的乙醇为提取溶媒,溶剂用量10倍,分别采用超声法提取30min,按2.1.2项下制备样品溶液测定,计算姜酮含量结果分别为0.623、0.778、0.834、0.901和0.770mg·g-1(n=2),结果表明乙醇浓度为80%左右较佳。2.2.4提取时间的确定在2.2.3溶剂考察基础上,选取80%浓度乙醇为提取溶媒,溶剂用量10倍,分别采用超声法提取20、30、40、50和60min,按2.1.2项下制备样品溶液测定,计算姜酮含量结果分别为0.707、0.801、0.822、0.842、0.835mg·g-1(n=2),结果表明,提取时间以50min左右较佳。2.3正交试验中的超声波提取方法2.3.1表中的因素根据“2.2”项下单因素考察结果,确定各因素和水平,采用L9(34)正交表进行正交实验设计,具体因素水平表见表1。2.3.2提取姜酮含量最佳工艺的确定按L9(34)正交表,以样品中姜酮含量为指标进行分析,实验结果见表3,方差分析见表2,表3。由表2结果可知,在姜酮含量中影响大小依次为:C>B>A>D,即溶剂倍数>提取时间>乙醇浓度>提取次数。直观分析得提取姜酮含量最佳工艺为A2B2C1D3,即乙醇浓度为80%,溶剂倍数为10倍,提取时间为40min,提取次数3次。由方差分析结果可知,B、C因素即乙醇倍数与提取时间对提取效果有显著意义,A、D因素即乙醇浓度和提取次数无显著性差异。综合直观分析(最佳条件为80%乙醇,12倍量,提取3次,每次40min)、提取工艺的可操作性以及工业化生产的节省能耗考虑,确定最佳提取工艺应为A2B2C1D1,即80%乙醇,10倍量,提取1次,每次40min。2.4进样姜酮含量测定按上述姜酮提取的的最佳提取工艺,进行3批验证试验,按2.1.1项下色谱条件进样,计算姜酮的含量分别为0.147%、0.163%、0.156%,平均含量为0.155%。表明该提取工艺良好,合理可行。3最佳提取工艺的确定《中国药典》2010年版一部对干姜和炮姜的含量测定项下规定为:以6-姜酚含量计算,干姜中6-姜酚含量不得少于0.60%,炮姜中6-姜酚含量不得少于0.30%。众所周知,依法炮制是保证药材质量的重要环节。课题组前期研究和文献报道均表明,干姜中6-姜酚类在砂烫炮制过程中会有较明显的降低,若只单以炮制过程会降低的6-姜酚含量来控制炮姜质量,无疑忽视了炮制过程的重要性,因而,增加炮姜在炮制过程中新生成分姜酮的含量检测来控制其质量,则可达到既能保证药材质量,又可兼顾炮制过程的效果。由于乙醇对姜中姜酚类成分提取效率较高,故本研究乙醇为溶剂。实验考察了乙醇提取的主要因素:乙醇浓度、乙醇倍数、提取时间、提取次数对姜酮提取得率的影响,经L9(34)正交试验的方差分析和直观分析结果与工艺生产实际操作性,最终确定最佳提取工艺条件:即提取溶剂为80%乙醇,加入倍数为10倍,提取1次,每次提取40min。实验采用的超声提取法耗能少,提取时间快,提取率高,是一种理想的提取方法,对于炮姜的质量控制研究具有较强的可操作性。实验过程中比较了AcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)和AcquityHSST3(2.1mm×50mm,1.8μm)两种色谱柱,考察了甲醇—水、乙腈—水、乙腈—0.1%磷酸水等流动相系统及梯度洗脱程序,也优化了柱温和流速等实验因素,最终得到本实验的色谱条件,建立的姜酮含量检测方法简单、稳定、重复性好,实验优化的提取工艺切实可行,可为炮姜的质量控制和进一2.1.7重现性试验rsd按2.1.3项下方法制备供试品溶液6份,精密吸取2μL,按2.1.1色谱条件下进样,记录色谱图,测得RSD