hplc法同时测定十二一株十二一株白凤丸中芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的含量

hplc法同时测定十二一株十二一株白凤丸中芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的含量

12乌凤丸是江西传统的方针方法。它由12种药物组成：鸡黄、地黄、山药、党参、白术、川药、祁病、当归、地黄、白芍（酒炒）、牡丹皮和五味子（酒药）。主要用于治疗月经不足、脾虚或肾衰竭。它被广泛用于月经和女子生理。十二乌鸡白凤丸标准中无含测项。另有复方乌鸡制剂药味与本制剂相同,其丸、口服液、颗粒及胶囊剂的质量标准中以芍药苷或含氮量为定量指标。文献报道仅见HPLC法测定复方乌鸡制剂中芍药苷的含量。本实验采用HPLC法对十二乌鸡白凤丸处方中白芍、牡丹皮、当归、川芎的主要有效成分芍药苷、阿魏酸和丹皮酚给予同时测定,方法简便快速,稳定可靠,便于控制制剂质量。1药品、化学品和阴性样品岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪(岛津公司);SPD10A紫外检测器;N2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息工程研究所);超声波清洗器SB2200(上海必能信超声有限公司);METTER-265-S型电子天平(瑞士)。芍药苷对照品(110736-200320)、丹皮酚对照品(110708-9704)、阿魏酸对照品(110773-9910),均购自中国药品生物制品检定所。十二乌鸡白凤丸(批号:20051101、20051102、20051103,江西半边天药业有限公司);阴性样品(自制)。试剂除HPLC用乙腈为色谱纯外,其他均为分析纯,水为超纯水。2方法和结果2.1流动相、测定波长及进样量根据经验及有关文献确定色谱条件[9,10,11,12,13,14]。色谱柱:DiaminsilC18柱(5μm,4.6mm×200mm);流动相:乙腈-0.1%磷酸水溶液,按表1进行梯度洗脱;流速∶1.0mL/min;柱温:30°C;检测波长:芍药苷230nm,阿魏酸320nm,丹皮酚274nm;进样量:20μL。理论塔板数按芍药苷峰计算不得低于2000,按阿魏酸峰计算不得低于5000,按丹皮酚峰计算不得低于5000。2.2溶液的制备2.2.1芍药提取物、阿魏酸和丙烯酸的对照溶液精密称取芍药苷、阿魏酸和丹皮酚对照品适量,加50%甲醇制成每1mL含150μg芍药苷、6μg阿魏酸和70μg丹皮酚的溶液。2.2.2超声处理法取十二乌鸡白凤丸研细,取约8g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加50%甲醇50mL密塞,称定重量,超声(功率250W,频率50kHz)处理30min,放冷,再称定重量,补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.3系统适应参数分别取供试品溶液、对照品溶液,按上述色谱条件实验,对系统适应参数进行考察,芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的理论塔板数分别为4037,5231,83839,分离度分别为2.217,5.829,5.610。2.4检测波长的确定分别取芍药苷、阿魏酸和丹皮酚对照品溶液在200～400nm进行光谱扫描,最大吸收波长分别为230,320和247,故确定芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的检测波长分别为230,320和247。2.5阴性样品色谱试验白芍、牡丹皮中含有芍药苷,当归、川芎中含有阿魏酸,牡丹皮中含有丹皮酚。取缺白芍、牡丹皮、当归、川芎阴性样品制成阴性供试液,按上述色谱条件进样,记录色谱图,结果阴性样品色谱图中未出现芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的峰。结果表明处方中的其他成分对芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的检测无干扰。见图1。2.6线性范围的考察分别精密吸取混合对照品溶液(每1mL含芍药苷423.8μg、阿魏酸20.12μg、丹皮酚212.6μg)0.5,1,2,3,4,5mL置10mL的量瓶中,加50%甲醇至刻度,分别精密吸取20μL,依次注入液相色谱仪,测定,以峰面积对浓度(μg/mL)进行线性回归。结果表明芍药苷、阿魏酸和丹皮酚分别在21.19～211.90,1.01～10.06,10.63～106.30μg/mL范围内呈良好的线性关系。线性方程分别为:Y=13675X+881.95,R2=0.9998;Y=51710X+899.60,R2=0.9996;Y=32546X+891.50,R2=0.9996。在含量测定浓度范围内,可忽略常数项引起的误差,采用外标一点法测定。2.7标准1:并测定添加物的最低检测限将芍药苷、阿魏酸和丹皮酚对照品溶液逐步稀释后进样,以信噪比(S/N)为3考察其最低检测限,芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的最低检测限分别为6.0,0.4,2.4ng。2.8精密度测试精密吸取混合对照品溶液20μL,重复进样测定5次,芍药苷、阿魏酸、丹皮酚峰面积RSD分别为0.81%、0.92%、0.97%。2.9峰面积rsd取供试品溶液分别于0,4,8,12,18,24h进样测定6次,芍药苷、阿魏酸、丹皮酚峰面积RSD分别为1.76%,3.41%,4.34%。2.10各组分含量测定取同一批号样品,平行制备6份供试品溶液,进样测定,计算各组分含量,芍药苷、阿魏酸、丹皮酚含量(μg/g)RSD分别为1.56%,2.05%,1.74%。2.11加样回收率测定取已知含量十二乌鸡白凤丸9份,精密称定,分别精密加入对照品溶液适量,按供试品项下操作并按含量测定方法进行测定,计算平均加样回收率。芍药苷平均加样回收率为98.63%,RSD为1.62%;阿魏酸平均加样回收率为98.35%,RSD为2.11%;丹皮酚平均加样回收率为99.12%,RSD为1.72%。结果见表2。2.12样品含量的测量取十二乌鸡白凤丸样品,按上述测定方法测定,计算芍药苷、阿魏酸和丹皮酚的含量。结果见表3。3对质控的作用本实验采用HPLC法应用梯度洗脱变换检测波长,同时测定十二乌鸡白凤丸中芍药苷、阿魏酸和丹皮酚3种指标性成分的含量,操作简便,快速可靠,对制剂的质量控制较为系统全面,可用于控制十二乌鸡白凤制剂的质量,对类似处方制剂的质控也具有借鉴作用。制剂HPLC图谱中,除已有归属的芍药苷、阿魏酸和丹皮酚外,保留时间10min左右有一大峰,