基于mdna细胞色素b序列分析乌骨鸡遗传多样性及系统进化

基于mdna细胞色素b序列分析乌骨鸡遗传多样性及系统进化

乌骨鸡是中国鸟类品种的基因库中具有特殊经济价值的宝贵鸟类。由于我国地域辽阔、生态环境多样、选种目标和饲养条件不同,再加上一些地域的封闭性,已形成了许多外貌、性能不同的乌骨鸡品种。为了能充分开发利用这一宝贵禽类资源,我国育种工作者针对乌骨鸡的遗传特性和生产性能的改良等方面已经开展了大量的研究和实践工作。以往关于乌骨鸡特性等相关的研究主要以RAPD和微卫星标记为主。目前,以mtDNA序列为分子标记运用DNA直接测序列的方法研究家禽遗传多样性和遗传分化及起源的研究报道越来越多。而有关mtDNA分子标记系统研究我国乌骨鸡的研究报道很少,仅分析了我国很少量的乌骨鸡品种的遗传多样性和系统进化。本研究运用DNA测序技术直接测定了丝毛乌骨鸡、金湖乌鸡、江山乌骨鸡、余赣乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、沐川乌骨鸡、兴文乌骨鸡、德化黑鸡、盐津乌骨鸡9个乌骨鸡品种的mtDNA细胞色素b基因520bp序列,分析乌骨鸡的遗传多样性和系统进化,以期为我国乌骨鸡的遗传资源保护和家鸡的起源提供可靠的基础资料。1血样、pcr和测序1.1样本的采集和DNA提取丝毛乌骨鸡、金湖乌鸡、江山乌骨鸡、余赣乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、沐川乌骨鸡、兴文乌骨鸡、德化黑鸡和盐津乌骨鸡9个品种的血样均采自原产地(公、母比例为3∶4~1∶1),见表1。血样均以翅静脉采集,柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝置于5mL指形管中,并保存于-20℃冰箱内。采集的血样采用常规的酚-氯仿法提取全基因组DNA。1.2DNA扩增和序列测定线粒体DNACytb基因扩增引物为L15218:5′-CCTATACTATGGCTCCTACCT-3′;H15754:5′-GCTAGTACGCCTCCGAGTTT-3′。PCR反应条件:95℃预变性5min;94℃变性45s,51~53℃退火45s,72℃延伸60s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。PCR产物交上海桑尼生物科技有限公司,采用柱式胶回收试剂盒回收,运用ABIPRISM3730测序仪进行序列测定。1.3统计分析测序结果通过Bio-Edit软件读取校对,通过Clustalx程序进行序列多重比对,用软件DnaSP4.10.7统计分析其多态位点、单倍型及其频率、核苷酸多态性,用MEGA4.0软件构建了NJ单倍型系统发生树,NETWORK4.5.0.1构建单倍型网络结构图。2乌骨鸡系统发育2.1遗传多样性用Dnasp4.10.7软件分析乌骨鸡mtDNA细胞色素b520bp序列的结果表明,在品种间和品种内未发现长度变异,碱基变异包括转换和颠换。9个乌骨鸡品种碱基T、C、A、G含量分别为24.6%、36.5%、26.2%、12.7%,共发现16个变异位点,其中单一多态位点8个(96、143、249、291、428、429、457、467),简约多态位点8个(77、137、146、155、191、276、399、452),16个变异位点可划分为13种单倍型(图1)。如表2所示,9个乌鸡品种中单倍型比例最高的是金湖乌鸡(50%),最低的是盐津乌骨鸡(14.286%);单倍型多样度为0~0.78571;核苷酸多样度为0~0.00399;金湖乌鸡的单倍型、核苷酸多样度最丰富;依次是江山乌骨鸡、余赣乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、丝毛乌骨鸡、沐川乌骨鸡、兴文乌骨鸡、德化黑鸡和盐津乌骨鸡的单倍型、核苷酸多样度最小。2.2乌骨鸡系统发育本研究选择GenBank上与所测的mtDNACytb序列相一致的4种原鸡序列。红色原鸡3个亚种,它们分别是分布于印度支那半岛、泰国和苏门答腊的G.g.gallus1(AP003322)和G.g.gallus2(AB044986),分布于印度尼西亚爪哇岛的G.g.bankiva1(AP003323)和G.g.bankiva1(AB0044985),分布于中国云南西部、西南部、印度支那半岛、缅甸和马来西亚北部的G.g.spadiceus1(AB044987)和G.g.spadiceus2(AP003321);其他3种原鸡分别是黑尾原鸡G.lafayettei1(AB044990)和G.lafayettei2(AP003325)、灰纹原鸡G.sonneratti1(AB044989)和G.sonneratti2(AP006741)、绿颈原鸡G.varius1(AB044988)和G.varius2(AP003324)。基于本研究测得的71条乌骨鸡序列和以上原鸡序列,用Dnasp4.10.3软件分析得到9个乌骨鸡品种和原鸡共有24种单倍型;构建NJ系统发生树(图2);见图3表明,大部分乌骨鸡的单倍型都与3种红原鸡归为一大类或遗传关系很近,而H4(YG3、JH3)、H5(JH1)、H8(MC1)与H21(G.sonneratti1)灰纹原鸡首先聚为一小类,再与其余乌骨鸡及红色原鸡聚为一大类,推断这9个乌骨鸡主要的母系起源为3种红色原鸡亚种,可能还含有少量的纹原鸡血缘。3不同品种鸡的起源及其起源遗传多样性一般是指种内不同群体之间或同一群体内不同个体的遗传变异。衡量一个品种(群体)mtDNA变异程度的主要指标是单倍型多样度(Hd)和核苷酸多样度(Pi)。Hd和Pi值越大,群体的多态丰富程度越高,其遗传多样性越丰富。本研究中金湖乌鸡单倍型、核苷酸多样度最丰富;依次是江山乌骨鸡、余赣乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、丝毛乌骨鸡、沐川乌骨鸡、兴文乌骨鸡、德化黑鸡、盐津乌骨鸡单倍型、核苷酸多样度最小;在这9个乌骨鸡品种中,金湖乌鸡遗传多样性最丰富,盐津乌骨鸡遗传多样性不丰富。而汤青萍等运用微卫星标记(SSR)研究我国主要乌骨鸡品种的遗传多样性的结果显示,盐津乌骨鸡在12个乌骨鸡品种中遗传多样性最丰富,而金湖乌鸡遗传多样性相对较低,与本研究结果不一致。究其原因可能与mtDNA属于细胞核外遗传标记,而微卫星标记属于核内标记反应的遗传信息不一致有关。为了从分子水平准确评价畜禽遗传多样性,必须增强分子标记评价的可靠性检验以及利用多种分子标记综合评价得出更加准确、全面和科学的研究结果,指导遗传资源的保护和利用。自19世纪达尔文认为红色原鸡是所有家鸡的唯一祖先、多元论学者认为红色原鸡是家鸡的主要祖先以来,国内外有关家鸡起源的问题一直未有最终的定论。Frisby等认为,红色原鸡很可能是家鸡的唯一祖先。而程光潮等用血型蛋白多态和DNA指纹等方法进行研究,认为中国地方鸡可能有独立的血缘来源。Fumihito等用线粒体DNA证据证明红色原鸡是家鸡的唯一祖先,并且还认为红色原鸡亚种实际上可以分为海岛型和大陆型2个类型,其中的大陆型是所有家鸡的共同祖先。而近几年国内学者的研究表明,我国家鸡起源于多个红色原鸡亚种。Niu等对我国6个地方鸡品种的线粒体DNA的研究表明,浙江省的5个地方鸡种至少有2个母系起源。Liu等研究认为,我国家鸡有5个母系起源,分别来自Gallusgallusgallus亚种和Gallusgallusspadiceus亚种,而欧亚大陆家鸡起源于亚洲的南部和东南部,同样有多个母系起源,红色原鸡在中国的驯化是多次、多地的,是人类长期选择的结果。宋春红等研究表明,文昌鸡、鲁西斗鸡、寿光鸡、济宁百日鸡、莱芜黑鸡和琅琊鸡等6个地方品种鸡的母系可能起源于云南、老挝等地红色原鸡的3个大陆亚种。朱文奇等研究表明,我国斗鸡起源于多个红色原鸡亚种,并经受了多次的独立驯化。贡潘偏抽等报道,瓢鸡在遗传组成上具有5个母系血统来源。刘丽仙等等报道,化坪乌骨鸡具有6个母系起源。目前,利用线粒体DNA分析家鸡的起源研究的结果来看,仍然存在一定分歧。但是根据以上研究报道并结合本研究结果,可以肯定家鸡肯定不是单一的起源于红色原鸡,我国不同家鸡品种(群体)有其不同的起源和特殊的演化历史,不能一概而论;另外,Erksson等根据家鸡、原鸡表型皮肤颜色观察及与黄皮肤相关的BCDO2基因的进化分析,表明大部分家鸡的血统里掺杂了灰纹原鸡的血缘。而本研究亦表明,我国乌骨鸡主要的母系起源为3种红色原鸡亚种,可能还含有少量的灰纹原鸡血缘,这说明我国家鸡的起源问题可能较为复杂。因此,本研究认为我国乌骨鸡的起源和系统进