木质纤维素降解机制的研究进展

木质纤维素降解机制的研究进展

资源和环境问题是人类21年面临的主要挑战。生物资源是可再生生物资源。地球上的年用化工产品达到1.5,101,2,0,1011吨。这是人类社会生存的基本物质来源，其中90%以上是木材纤维材料，目前这些资源尚未完全开发利用。随着世界人口的快速增长和矿产资源的逐渐稀缺，我们必须有效地开发和转化木材纤维资源的微生物技术，并利用工农业废物和其他燃料和原料生产人类所需的燃料、饲料和化工。换句话说，提取原材料的“绿色化”具有极其重要和光明的发展前景。与淀粉酶相比,纤维素酶的分子转换率要低数十倍.长期以来,关于纤维素降解机制的研究都集中在内、外切纤维素酶(cellobiohydrolaseⅠ,CBHⅠ;endoglucanaseⅠ,EGⅠ)怎样催化纤维素分子链的β-1,4-糖苷键的水解作用方面.20世纪80年代末期在得到了内、外切纤维素酶催化结构域(catalyticdomain)的结晶,进行了序列分析和解析了其三维结构等研究的基础上,已基本上弄清纤维素酶催化的水解反应与溶菌酶相似,即都遵循“酸/碱催化”的双置换作用机制.虽然在分子水平上的研究工作已相当深入,但仍然未能阐明天然结晶纤维素难以被降解的原因.我们认为,这主要由于忽略了纤维素分子的超分子结构,即聚集态结构对降解的影响所造成.针对这些难点,开展了多方面的探索性研究,现把取得的进展做一简介.1纤维素功能的变化酶催化反应中,酶分子和底物的构象都会发生相应的变化,即“诱导—契合”过程,但纤维的表面不存在游离的分子链,它们都为葡萄糖残基上3个羟基形成的氢键定向排列为各种取向的聚集态结构.外切纤维酶的活性中心是陷入其催化域内的隧道状结构,只能容纳单一的基元纤维链(葡聚糖链)进入,和在链末端进行水解.因此,Sinnott提出在纤维素分子链中的β-1,4-糖苷键发生水解之前,必需有单一分子链的游离.然而,这都只是推测.1997年我们报道了拟康氏木霉纤维酶经木瓜蛋白酶有限酶切,得到其外切和内切纤维素酶分子的催化结构域,结合结构域(cellulosebindingdomain,CBD).CBD具有非水解性的破坏纤维结构,形成短纤维的功能.此后,通过基因工程方法在微紫青霉和瑞氏木霉中克隆出的结合结构域也表现出同样的功能.扫描隧道显微图像显示出经外切纤维素酶吸附结合结构域作用后,微纤维间的排列表现出无序化和单一基元纤维链分离的情景(图1).而用纤维长度和粗度自动测量仪,对数千根纤维的纤维长度和粗度的自动测量的结果(表1).更进一步证实了经CBD作用后,微纤维键间氢链结合减弱,吸水力增加,导致纤维溶胀(直径增大)的结果.这与红外光谱分析结果也相一致(图2,3).上述实验结果,清楚地显示出经CBD作用后,纤维素聚集态结构的变化,为近年来关于纤维素在酶解过程中其超分子结构应发生变化的推测,给予了试验证实.2分子活性化合物远在半个世纪前,Reese等即提出应存在破坏结晶纤维素的“氢键酶”,但遗憾的是至今未能在微生物中获得证实.1994年,McQueen-Mason,等在黄瓜胚轴中,分离出一种蛋白质——“expansin”,具有使离体的植物细胞壁伸长的作用,也可使滤纸强度减弱,但无还原糖的产生.他们推测这类酶应具有破坏氢键的作用.近来我们由T.pseudokoningii滤液中分离到一个分子量约为24×104的蛋白,pI为7.0.它可使棉纤维,几丁质等膨胀但无还原糖的产生.红外光谱分析表明,它确可减弱棉纤维的氢键区的吸收强度(3600～3200cm-1羟基吸收区)关于它的结构与功能的研究正在进行中.3转换株的产生机理1996年以来,先后从分属于18属的约50种(株)真菌中检测到可氧化性降解纤维素的短肽类化合物[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13].在拟康氏木霉中和密粘摺菌的培养滤液中分离到毛细管电泳纯的短肽组分:“singlefibergenegationfactor,SFGF”和“Gloeophyllumtrabeum,Gt”,1),并用电子自旋共振法(ESR)检测到Gt引发的羟基自由基HO.和超氧阴离子自由基的产生(图5).结合由其导致的纤维素物理、化学性质的变化,提出了这类短肽化合物,络合并还原铁(Fe3+),活化分子氧,引发Fenton反应和氧化纤维素羟基,促进糖苷链断裂,形成短纤维的作用机理,1).纤维素和木素主要存在于植物细胞次生壁的中层,大分子的酶无法直接进入次生壁.但电镜切片可观察到,次生壁可首先发生降解.于是研究者们推测,应存在此类可降解木素,纤维素的低分子类化合物.但由于观察到的现象都来自粗酶滤液的混合作用,难于确证.在1997年,才见有部分纯化此类物质的报道.我们在证实此类物质普遍存在的基础上,基于对纯组分(SFGF/GT)的系统研究提出了它们作用机理的模式图.表明氧化性降解也是纤维素生物降解的一个组成部分(图6,7),这在过去研究中是被忽略的.上述实验表明,Gt因子产生HO.依赖于Fe3+并需要O2,H2O2的参与.由此推断,Gt因子可能通过Fenton反应产生OH.,在图5(b)中还出现了一个三重峰,表明体系中有的形成且推测是Gt因子的加入、Fe3+的还原驱动了超氧阴离子自由基的形成,.我们由此可推测H2O2的形成途径:众所周知,H2O2的形成可通过O2接受两个电子形成或接受一个电子产生这两条中间途径,由图5(b)所知体系中产生了,因此可以断定,H2O2是通过这一中间路径产生.在生物系统中,极易通过歧化反应形成H2O2,,或者通过接受两个来自Fe2+的电子而形成H2O2,.虽然无法分辨H2O2由上述哪条途径产生,但可以断定Gt因子介导的H2O2的生成是通过超氧阴离子自由基——这一中间产物形成的,在这个过程中,Gt因子还原Fe3+是OH.生成的前提,Fe3+的还原驱动了的产生,从而引发了H2O2的形成.4杂合酶的结构与功能经木瓜蛋白酶有限酶切和系列分离纯化后,得到了拟康氏木霉内切、外切纤维素酶的催化结构域和纤维素结合结构域.测定了CBHⅠ,EGⅠ全酶分子及其2个结构域在纤维材料上的吸附和脱吸附能力,以及它们酶解几种纤维材料时的比活力.结果表明,虽然单一的CD或CBD仍然可表现出水解和吸附能力,但是任何单一的结构域,或者两个结构域等物质的量的混合液的水解或吸附能力,都远低于其相应的全酶分子.例如,CBHⅠ的CBD及CD都可吸附于棉纤维上,但很易被洗脱.而CBHⅠ全酶分子吸附后,用1mol/LNaCl也洗脱不下来.CBHⅠ和EGⅠ协同降解结晶纤维素的功能,也只能体现在这2个酶分子共同反应条件下,用等物质的量的4个结构域的混合液作用时,表现出的协同能力大为降低.进而用来自不同纤维素酶分子的CBD和CD,用基因工程方法组建成杂合酶分子,深入探讨了其结构与功能的关系1).瑞氏木霉.EGⅢ的Km值比EGⅠ的低几百倍,而其转换数(Nt)则比EGⅠ的低50～200倍,结果,这两种酶的催化效率(Nt/Km)处在同一数量级上.从理论上讲,将底物亲和力高的EGⅢ的CBD区与催化能力强的EGⅠ的CD区杂交组合起来,有可能提高酶的催化效率.本实验室已经克隆到了EGⅢ基因.为了研究链接区的功能及CBD与CD区的相互作用,从瑞氏木霉cDNA文库中克隆出EGⅠ基因,采用重组PCR技术将编码EGⅢ信号肽、CBD和链接区(第1～90位氨基酸)的基因片段与编码EGⅠ催化区(第1～371位氨基酸)的基因片段重组为杂合酶基因,转入酿酒酵母中表达.对EGⅠ,EGⅢ和杂合酶的最佳作用温度及pH值的测定结果显示,3种酶的最佳作用温度均为60℃,和pH值为5.0.它们在最佳作用条件下酶的比活分别为:0.98,1.11,0.28IU/mg蛋白,与其双亲相比,杂合酶的蛋白分泌量没有明显变化,但比活力却显著降低.EGⅠ,EGⅢ和杂合酶对磷酸膨胀纤维素的吸附力分别为:66.5%,74.9%和37.7%.显然,杂合酶对纤维素的吸附能力也明显下降.杂合酶与其亲本性质的比较结果说明,杂合酶EG的CD和CBD的重组并未能体现两个结构域之间简单的协同作用关系.造成重组酶活性改变可能有两方面原因:(ⅰ)CBD和CD虽然可以彼此独立,而保持各自的结构和功能,但是,当这两个结构域之间通过一段由34个氨基酸组成的铰链区连接成一条肽链,折叠为具有三维空间结构的酶分子时,CD和CBD的肽链之间相互影响,相互作用,会改变它们的三维空间结构.如果同源的CD和CBD的连接,它们的拓扑空间结构适合于降解纤维素.反之,异源的CD和CBD的重组,可能会破坏它们的最适作用的空间结构,致使杂合酶对纤维素的吸附及降解能力都显著降低.(ⅱ)尽管EGⅠ,EGⅢ如CBHⅠ,CBHα都有两个结构和功能的区域:一个CD连结一个CBD,而且,它们的CBD有70.5%的同源性,但是,EGⅠ和CBHⅠ的CBD位于酶分子的C-端,EGⅢ和CBHⅡ的CBD却位于蛋白质的N-端.CBD和CD之间的方向性可能与它们的三维结构及其协同作用关系密切,从而对纤维酶分子的整体结构影响很大.EGⅠ的CBD从酶分子C-端删除,而在其N-端加上EGⅢ的CBD,这样,重组酶分子上的两个结构域的相对位置发生了改变,不利于它们之间的协同作用.因而,重组酶对纤维素的降解能力显著下降.5棉纤维酶的功能纤维素酶在酶解过程中的失活和残余纤维素结晶度的增加,曾被认为是纤维素难被酶降解的主要原因.我们在研究中发现,多次使用新鲜纤维素酶液酶解残存纤维时,并未能提高其酶解效率.另外,当无定型区被酶解后,结晶区在大幅度被酶降解过程中,其结晶度基本不变,但酶的吸附效率却大幅度减低,而活化能却大幅度增加.这都反映了上述认识的局限性.CBD作用棉纤维后(图2,3)导致微纤维链间氢键结合减弱,吸水力增加,纤维溶胀.但对长期酶解过程中,棉纤维样品的红外光谱的比较还可看出,纤维素晶格发生了由Ⅰ型到Ⅱ型的转变.纤维Ⅱ中氢链平均长度较纤维素Ⅰ为短,堆砌数为紧密,所以它在热力学上较稳定.而发生这些复杂的超分子结构的动态变化,在过去酶解过程研究中被互略.由于一个纤维素酶分子如CBHⅠ(图8)吸附纤维时,其宽度要跨越2～4根微纤维,其排列间隙的加大和取向无序化,都会造成纤维素酶吸附的困难,而纤维素酶的吸附是其降解固体纤维素的必需阶段,水解速率又正比于吸附量.我们认为,上述超分子结构的变化,应是导致纤维素酶在残存的纤维上吸附能力显著下降,而水解活化能却显著增加的原因,因而难以被酶降解.6cdh促进木素酶及木素降解作用CDH发现20余年来,只明确它可氧化纤维二糖,但它在木素和纤维素降解中的作用却不清楚.我们的研究表明,在23种(株)真菌中,9种可合成CDH的既能降解纤维素又能降解木素的菌株,表明它与木素的降解有关.进一步观察到,裂菌褶的纤维二糖脱氢酶,可以氧化纤维二糖并还原多种物质,催化的是一双底物双产物反应,符合乒乓机制.在电子供体纤维二糖存在下,CDH可以还原由豆壳过氧化物酶(soybeanhulloeroxidase,SHP)氧化多种芳香化合物所生成的产物.SHP氧化1-羟基苯丙三唑(hydroxybenzotriazole,HBT)生成的产物对SHP有失活作用.而在纤维二糖存在下,CDH可以还原该氧化产物,从而阻止其对酶的失活作用.CDH还可以抑制SHP氧化聚合愈创木酚等酚型化合物的反应.从而证实CDH可以促进木素酶对木素的降解.继而发现,在白腐菌的锰过氧化物酶(Mnp)酶解硫酸盐浆酶分离木素(cellulaseenzymalysislignin,CEL)时,加入CDH,能使木素降解溶出物质明显增加,表明CDH也能促进Mnp的降解作用,使CEL中甲氧基、羟基、酚羟基和总羟基含量减少.1HNMR分析表明,锰氧化物酶处理时,加入CDH还能使CEL中质子数进一步减少.实验结果证实,CDH具有促进Mnp对木素降解的作用,从而表明CDH不仅能促进纤维素降解,而且也是木素生物降解体系中的重要组成部分之一.7ph诱导的结合在纯化得到内、外切纤维素酶的纯组分并对酶的生物学、物理化学性质研究的基础上,进行了2类酶的内源荧光、圆二色谱、氨基酸残基化学元素修饰及酶解过程中动力学的比较研究.目的是探索色氨酸在内、外切纤维素酶结构与功能关系中的作用.结果表明,它位于酶的活性位点附近,而且与底物结合有关.荧光光谱测定指出,酶的荧光几乎都来自色氨酸残基.在酶分子中,色氨酸所处微环境对pH变化非常敏感,降低pH导致了酶分子构象发生了较大变化.配基结合使酶分子色氨酸环境产生了改变,引发了与pH诱导不同的构象变化.表明色氨酸很可能位于或接近酶的底物结合位点.荧光激发和发射峰值测定结果表明:配基(纤维二糖)结合使色氨酸微环境发生了变化,很可能使色氨酸从羧基或咪唑基的附近离开了,而导致荧光不再表现大的pH依赖性.pH诱导的结合是敏感的,降低pH可能导致了一些色氨酸更加暴露;配基结合改变了色氨酸的微环境,同时使酶分子构象发生了变化,但酶的整体构象不再随pH变化.并由此证明,内、外切纤维素酶催化结构域三维结构的细微差别,是其底物专一性不同的原因.以低浓度的十二烷基磺酸钠(SDS)为微扰剂处理外切酶CBHⅠ时,可显著增加CBHⅠ的内切酶活力.荧光和圆二色谱测定表明,其内切酶活力增加的原因可能为CBHⅠ活性部位附近色氨酸所处微环境变化所致.进一步观察N-溴代琥珀酸钠修饰内切酶EGⅠ时,酶活力的完全丧失先于酶的荧光强度淬灭发生,增加纤维二糖浓度可增加对酶荧光淬灭发生的保护,表明催化结构域中的色氨酸位于底物结合位处.用荧光和圆二色谱研究了CBHⅠ和EGⅠ在不同pH和配基结合时的构象变化,无配基时,两者构象变化相似,加入配基时导致了不同的变化.在低pH区,EGⅠ构象变化的pH依赖性较CBHⅠ大,EGⅠ较CBHⅠ更易受外源干扰.这都表明,EGⅠ活性部位的“结合色氨酸”较CBHⅠ的“结合色氨酸“更加暴露于溶剂中.根据上述试验结果,我们提出了一个解释内、外切纤维素酶与表纤维作用时,底物专一性不同的运动模式:CBHⅠ活性部位呈桶状,只能允许单根纤维分子链进入.EGⅠ活性部位为一开放的裂隙,可使酶分子“骑”在纤维表面上,进行随机性内切,水解出纤维寡糖(图9).8糖基化是纤维素酶水解纤维素活力的手段纤维素酶分子都是糖基化的糖蛋白,但对其糖基化的功能一直没有确认.我们分析了纤维素酶被木瓜蛋白酶有限酶切的结果,发现其酶切位点都位于“linker”附近.而且是发生在一些由Gly,Ser和Thr组成的寡肽上.而这样的肽已被证明是蛋白酶的酶切位点:G-S-T,A-G/G-A,G-G-Y,这里的Y时常是疏水基团.我们和已报道的结果都表明:糖基化不是纤维素酶水解纤维素活力所必需.什么是糖基化的作用呢?仔细考察不难发现:外切酶的linker是糖基化的,内切酶的linker不是糖基化的,外切酶的linker中含有一些可能的蛋白酶切位点,而内切酶中却几乎没用.所以,糖基化的作用应该是防止蛋白酶切.这种作用对纤维素酶的功能可能是很重要的.但是这些基于序列分析的认识还需进一步的试验证实.我们进一步利用体外无细胞系统(不含催化糖基化的酶类),研究了微紫青霉CBHⅠ的表达和调控机制.分别以pGEM-3ZcDNA和扩增的DNACBHⅠ为转录-翻译模板,在体外兔网织红细胞裂解液中成功表达了不含糖基化的CBHⅠ,表达量达21.7μg/mL.以二糖苷(pNPC)为底物,表现为有正常活力的酶蛋白.CBHⅠ在体外兔网织红细胞裂解液中,得到正确转录和翻译成非糖基化的CBHⅠ,和糖基化修饰并不影响纤维素酶比活力的结果,进一步为糖基化的作用是防止蛋白酶水解的新观点提供了试验证据.9关于纤维素酶活性位点的研究在对纤维素酶分子结构与功能研究的基础上,为了对其进行蛋白质工程设计提供新的线索,我们对已知其三维结构的23个酶(分属于6大类酶)的活性位点区域的氨基酸残基出现规律做了统计分析.发现它们都是富含G(甘氨酸)-X-Y残基的,而且一般以G-X-Y(或Y-X-G)寡肽出现,与X,Y残基的极性相反,它们的分子量和极性也较小,G-X-Y寡肽出现的频率远较其他区域高.酶的其他区域则无此特征性寡肽,表明甘氨酸可为酶类活性部位提供柔性,这是酶活性位点构象变化所必需的.以纤维素酶和过氧化物酶为例,对此做了构象分析.表明用G-X-Y寡肽来构