《工业酶制剂通用试验方法》测定酸性蛋白酶活力的探讨

《工业酶制剂通用试验方法》测定酸性蛋白酶活力的探讨

作为一种饲料添加剂，酸性葡萄酶在饲料生产中的应用非常普遍。这可以补充动物胃肠道中酸性葡萄酶的不足和不足，提高动物对饲料的消化利用率。同时，酸性葡萄酶可以显著促进幼种肥力的生长发育，减少断奶引起的压力。因此,酸性蛋白酶是一种应用前景十分广阔的饲料添加剂。酶活力是衡量酶生物催化活性的一个重要指标,但我国目前尚无饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶活力测定的国家标准和行业标准,市场上出现的该类产品其企业标准大多采用中华人民共和国轻工行业标准《工业酶制剂通用试验方法》(QB/T1803-1993)来检测产品中酸性蛋白酶的活力。笔者在实际应用过程中发现,直接用该方法检测饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶的活力收率甚低。为此,本文就《工业酶制剂通用试验方法》测定饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶的活力进行试验研究,以期找到有效的检测方法,为饲用酶添加剂预混料产品的质量控制提供检测依据,为制定国家或行业标准提供参考。1试验材料和方法1.1试验材料1.1.1原料的混合与成酶制剂(试样Ⅰ、试样Ⅱ)由酸性蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶和玉米粉载体按一定比例混合而成,所使用酶制剂原料均由肇东市日成酶制剂有限公司生产。1.1.2试剂的类型乳酸(80%～90%)、乳酸钠(70%)、碳酸钠、三氯乙酸、钨酸钠、钼酸钠、磷酸(85%)、盐酸、硫酸锂、浓溴水(99%)、干酪素(北京奥博星生物技术有限责任公司)、L-酪氨酸(Sigma公司)(所用试剂未加注明均为分析纯)。1.1.3不同试剂的配制酪素溶液(10g/L)、L-酪氨酸标准溶液(100μg/mL)、乳酸缓冲溶液(pH3.0)、三氯乙酸溶液(0.4mol/L)、碳酸钠溶液(0.4mol/L)、福林试剂等均按QB/T1803-1993《工业酶制剂通用试验方法》<附录A酶活力的试验方法>A3.2福林法(第一法)之规定制备。1.2温度、分光光度计分析天平:感量为0.0001g;恒温水浴摇床:温控30～60℃±0.1℃;秒表;移液枪(精度10μL);分光光度计(北京普析通用仪器公司,TU-1901);离心机(6000rpm)。1.3测试方法1.3.1酸性酶活性物质的定义在40℃和一定的pH条件下,1min水解酪素生成1μg酪氨酸所需的酶量,定义为一个酶活力单位,以U表示。1.3.2酶解过程中样品的制备以QB/T1803-1993《工业酶制剂通用试验方法》<附录A酶活力的试验方法>A3.2福林法(第一法)为基础,将A3.2.4.2测定“(1)待测酶液的制备”中“用四层纱布过滤,滤液……”步骤用“取适量6000rpm(1200×g)离心10min,取上清液……”替代。以下步骤同A3.2.4.2测定之“(2)测定”。之所以对该部分进行修改,是因为离心是当前样品分离普遍采用的手段,其优点是方便快捷、分离效果好。1.3.3待测酶液的制备在QB/T1803-1993《工业酶制剂通用试验方法》<附录A酶活力的试验方法>A3.2福林法(第一法)的基础上将其中A3.2.4.2测定之“(1)待测酶液的制备”修改为:精密称取酶粉适量置研钵中,用少许乳酸缓冲液湿润,用力研磨数分钟,加入适量乳酸缓冲溶液混匀,静置,将上层清液转移至100mL容量瓶中,沉渣部分继续研磨数分钟,再用少量缓冲液溶解,将上层清液转移至容量瓶中,如此反复3～4次,最后将试样全部转移至容量瓶中,用缓冲溶液定容至刻度,摇匀(酶活力应控制在8～10U/mL范围内),此混悬溶液直接供测试用。以下步骤同A3.2.4.2测定之“(2)测定”。2结果与分析2.1酸性蛋白酶原料活力测定为了确定试验样品中酸性蛋白酶的理论含量,按照1.3.2《工业酶制剂通用试验方法》对试验用酸性蛋白酶原料的活力进行测定,其测量结果见表1。根据表1平均含量结果计算,试验样品Ⅰ中酸性蛋白酶理论含量为958U/g,试验样品Ⅱ中理论含量为826U/g。2.2工业酶制剂通用试验方法为了检验《工业酶制剂通用试验方法》对饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶活力测定的适用性,按照1.3.2《工业酶制剂通用试验方法》对试验样品Ⅰ和试验样品Ⅱ的酸性蛋白酶活力进行测定,测量结果见表2。表2结果显示,《工业酶制剂通用试验方法》的回收率只有70%左右。表明,《工业酶制剂通用试验方法》不适用于饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶活力的测定。这说明其他酶的存在可能是造成酸性蛋白酶活力测定回收率低的因素之一。2.3酸性蛋白酶活力测定为了弄清酸性蛋白酶的活力测定是否受其他酶存在的影响,我们设计了以下试验,将玉米粉、酸性蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶原料分别制成一定浓度的单一溶液,再按照1.3.2《工业酶制剂通用试验方法》测定不同组合的混合酶液(按照试验样品中酶的浓度进行配比)中酸性蛋白酶的活力。测量结果见表3。从表3测量结果可以看出,无论双酶、三酶、四酶还是五酶组合,其酸性蛋白酶活力测定结果相差不大,与同次试验中原料酶活力测定结果93055U/g基本一致,酶活力并没有明显的降低。表明在酸性蛋白酶活力的测定中其他酶的存在不会影响酸性蛋白酶活性的发挥,先前的推测是不成立的。2.4最佳载体的确定结果一次偶然事件发现,没有经过离心处理的试样上清液的酶活力测定值高于离心上清液的测定值,进一步试验显示不经离心处理的混悬液测定值更高。分析认为,载体的吸附作用可能是主要的影响因素。为此,对原方法进行修改产生了1.3.3《工业酶制剂通用试验方法》改进方法。按照改进方法对试验样品Ⅰ和试验样品Ⅱ中酸性蛋白酶活力进行测定,测量结果见表4。从表4的结果可以看出,《工业酶制剂通用试验方法》改进方法的回收率在93%～99%之间。这一结果表明,载体对酸性蛋白酶的确存在着较强的吸附作用,并且这种吸附不会影响酸性蛋白酶活性的发挥;同时也证明《工业酶制剂通用试验方法》改进方法可以作为饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶活力测定的检测方法。2.5白酶原料检测在试验过程中发现,饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶活力的测定中样品空白吸收度值偏高,为了查清原因,笔者以酪素以及用其他酶代替酪素作底物,用1.3.2《工业酶制剂通用试验方法》对酸性蛋白酶原料进行样品和样品空白吸收度值测定,测量结果见表5。从表5数据可以看出,一方面,酪素和以纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶为底物的样品、样品空白的吸收度值都很低,且以纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶为底物的样品和样品空白吸收度值基本一致,说明这些酶虽然也是一种蛋白质,但是酸性蛋白酶对他们没有酶解作用,或者虽然有酶解作用,但不生成酪氨酸和含有酚基的其他氨基酸或者这类氨基酸的生成量很少。另一方面,以淀粉酶为底物的样品和样品空白吸收度值都比较高,且基本相同,表明酸性蛋白酶对淀粉酶也没有酶解作用,但淀粉酶本身可能含有酪氨酸或者其组成氨基酸中含有酚基。3饲用酶添加剂预混料中酸性蛋白酶活力测定在饲用酶添加剂预混料的酸性蛋白酶活力测定中,其他酶对酸性蛋白酶活力的测定没有太大的影响,其影响可以忽略。在饲用酶添加剂预混料的酸性蛋白酶活力测定中,载体对蛋白酶存在着很强的吸附能力,处理不当会影响酸性蛋白酶活力的测定;直接用试样混悬液进行测定是饲用酶添加