兽用聚肌胞注射液鉴别研究

兽用聚肌胞注射液鉴别研究

双瘤：双醇：c，这是由双醇和双烯酸在一定条件下混合的。这是一种高效的抗病毒性药物（ifn）抗生素，具有广阔的光谱抗病毒、肿瘤、部分细菌和原生动物感染、刺激和吞咽、身体免疫等多种保护作用。PolyI:C注射液目前已广泛应用于人医临床诊疗中,显示了良好的抗病毒、抗肿瘤效果。而PolyI:C注射液在动物病毒性疾病防治中尽管也有显示其良好抗病毒效果的报道,但PolyI:C至今尚未获得国家农业部允许其在动物病毒性疾病治疗上应用的正式许可。鉴于目前兽医临床上抗病毒类药物严重匮乏的现实,为了实现PolyI:C将来在畜牧养殖业中的应用和推广,有必要展开PolyI:C在动物机体使用效能的系统研究,其中制订兽用PolyI:C制剂的质量标准是其研究的必要内容之一。本文的主要目的在于建立兽用聚肌胞注射液的检测方法和质量检验标准。1材料和方法1.1仪器和标准品兽用PolyI:C注射液由瑞普(天津)生物药业有限公司研发中心提供,批号为08080601,含量为1mg/mL,标准品tRNA为Sigma公司产品,批号R8759,含量99%;紫外分光光度仪(TU-1900双光束紫外可见分光光度计)为北京普析通用仪器有限责任公司产品;圆盘电泳槽(DYCZ-27B型)为北京市六一仪器厂产品。1.2polii：c的识别1.2.1菲啶溴红的紫外观察取兽用PolyI:C注射液1mL,加入菲啶溴红溶液(取0.02mg菲啶溴红加入100mL水即得)0.5mL,置紫外灯(254nm)下观察。1.2.2紫外分光光度法取兽用PolyI:C注射液1mL,加入氯化钠-磷酸盐缓冲液(pH7.2),制成每毫升中约含有0.04mg的溶液,按照中华人民共和国兽药典2005年版一部介绍的紫外分光光度法进行测定。1.3polii：c的定量检测1.3.1样品的消化与测定对照品溶液的制备:精密称取105℃干燥至恒重的磷酸二氢钾2.195g,置500mL容量瓶中,加水使溶解并稀释至刻度,摇匀,再精密量取5mL,置500mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀即得每1mL中含磷10μg的溶液。PolyI:C注射液消化处理:精密量取兽用PolyI:C注射液1mL,置凯氏烧瓶中,加5mol/L硫酸溶液3.0mL,于140～160℃消化2～4h。待溶液呈黄褐色后,放置冷却,加30%过氧化氢1～2滴,继续消化,直至溶液透明。放置冷却后,加水0.5mL,水浴加热10min,放置冷却,转移至50mL量瓶中,加水至刻度。线性试验:精密量取兽用PolyI:C的消化稀释液0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5mL,分别加水2.6,2.4,2.2,2.0,1.8,1.5mL,然后加入定磷试剂(6mol/L盐酸-水-2.5%钼酸铵-10%抗坏血酸1:2:1:1)3mL,摇匀,45℃加热25min,立即冷至室温。按照分光光度法,在660nm的波长处测定吸收度。溶液稳定性:取兽用PolyI:C注射液消化后显色,冷至室温,并在室温下(25℃)放置,分别于0,1,2,3,4h,在660nm波长处测定吸光度。回收率试验:精密称取聚肌苷酸和聚胞苷酸各50mg,加水溶解后转移至100mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀得供试品溶液。精密量取供试品溶液0.8,1,1.2mL,每样3份,共9份,经消化处理。放冷后,加水0.5mL,水浴加热10min,放冷,转移至50mL量瓶中,加水至刻度。然后按样品测定项所述进行含量测定,计算回收率。样品测定:精密量取兽用PolyI:C消化稀释液1mL,加水2mL,定磷试剂3mL,摇匀,45℃加热25min,立即冷至室温,660nm波长处测定吸收度。精密量取兽用PolyI:C注射液2mL,置离心管中,加沉淀剂(钼酸铵1g,加70%过氯酸14mL,水386mL)2.0mL,摇匀,4000r/min离心15min,精密量取此溶液1mL,置25mL量瓶中,加水至刻度,摇匀。精密量取此溶液1mL,同上法自“分别加水2mL”起,依法测定。精密量取对照品溶液0.8mL,分别加水2.2mL,定磷试剂3mL,摇匀,45℃加热25min,立即冷至室温。在660nm波长处测定吸收度。同法测定6份PolyI:C样品。PolyI:C(%)=(总磷量-无机磷量)×10.25/m×100%。其中10.25为核酸与磷的折算系数;m为取样量。1.3.2trna检测限的确定参照文献的方法进行。标准品溶液的制备:取已知沉降系数为4S的核糖核酸(tRNA),加水制成每1mL含1mg的溶液。取1mL,加入溴酚蓝指示液1滴和蔗糖0.4g,使溶解,备用。供试品溶液的制备:取兽用PolyI:C注射液1mL,加入溴酚蓝指示液1滴和蔗糖0.4g,使溶解,备用。检测限试验:精密称取标准品核糖核酸(tR-NA),加水制成每1mL含10mg的溶液,分别精密量取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL置10mL容量瓶,加水稀释至刻度;取1mL,加入溴酚蓝指示液1滴和蔗糖0.4g。再分别取上述溶液各100μL(含tRNA分别为10,20,40,60,80,100μg),分别加入6支凝胶柱中,进行电泳。操作法:供试品、标准品两种溶液的上样量均为100μL,调整电流至每管约5mA,4～10℃下电泳约1.5～2h(待溴酚蓝色环达到距底端2cm处即可)。取胶后进行染色和脱色,将胶条置灯下观察,根据供试品、标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。同样方法分别在6支圆盘电泳槽的凝胶柱中进行电泳。按下式计算相对迁移率:相对迁移率(Rf)=加样端到供试品或标准品区带的距离/加样端到溴酚蓝区带的距离2结果2.1荧光增强的nm将加入菲锭溴红的兽用PolyI:C注射液,置紫外灯(254nm)下观察,可见荧光明显增强;特征光谱扫描结果显示,兽用PolyI:C注射液在266nm波长处有最大吸收,在231nm波长处有最小吸收(图1),吸光度分别为0.542和0.407。2.2实际检测结果以吸收度为纵坐标,取样量为横坐标,进行线性回归,测得线性相关系数为0.9999,表明在0.4～1.5mL的取样量范围内,兽用PolyI:C消化液取样量与吸光度的线性关系良好(表1)。根据检测结果计算,兽用PolyI:C注射液含量为97.8%(6批PolyI:C注射液含量分别为97.8%,96.5%,100.2%,97.4%,93.4%,98.7%,所得结果的RSD为2.3%,重复性良好)。显色反应后的对照品溶液及兽用polyI:C溶液在室温(25℃)条件下放置4h内稳定(表1)。回收率试验结果显示聚肌胞注射液的加样回收率良好(表2),平均回收率为100.81%,RSD为2.02%。兽用PolyI:C注射液沉降系数检查结果显示,其迁移率小于标准品的迁移率(表3),说明其沉降系数大于4S。检测方法重复性良好(RSD=2.27%)。而且检测限试验结果显示,当点样量为20μg时,即能较清楚地检视。3测定polyi:c含量的方法PolyI:C为双链核酸,与溴乙锭(EB)结合后可产生较强荧光,而单链、三链PolyI:C则无此现象。试验结果显示,PolyI:C在200～300nm的波长范围内有紫外吸收,在266nm波长处有最大吸收,231nm波长处有最小吸收。据此可以对PolyI:C注射液进行定性鉴别。曾有用荧光法测定聚肌胞含量的报道,此法专属性较强。但所用试剂EB是强诱变剂,可以嵌入碱基分子中导致错配,容易引起有机体突变,具有高致癌性。从而限制了该法的使用。由于PolyI:C为含磷有机化合物,分子中含两个磷,每1mg的磷相当于10.25mg的PolyI:C,因此,通常应用定磷法来测定PolyI:C的含量。在酸性环境中,定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸,当有还原剂存在时磷钼酸立即转变成蓝色的还原产物钼蓝,钼蓝在660nm波长处有最大吸收。而且由于在一定浓度范围内,颜色的深浅与磷含量成正比关系,因此可应用分光光度法进行磷的定量测定。但在具体检测时,测定供试品中PolyI:C的总磷量需用硫酸或过氯酸消化成无机磷后方可再行测定,根据供试品中总磷量减去无机磷量,即得PolyI:C的含磷量,并由此计算出PolyI:C的含量。我们的试验结果显示,PolyI:C注射液的平均含量为97.8%,其重复性良好(RSD为2.3%),平均回收率为100.81(RSD为=2.02%)。我们在试验中也发现,利用定磷法测定核酸时,尽管样品先经过消化后能消除一些物质的干扰,而且定磷试剂与磷生成深蓝色的钼蓝,专属性强,灵敏度高,可广泛应用于各种复方制剂中核酸含量的测定,不过,定磷法易因消化操作的条件而产生误差,操作中要格外注意。沉降系数与粒子的大小有关。在一定条件下,生物高分子的相对分子质量大者,其沉降速度(沉降系数)较大。当对某些生物高分子的化学结构或相对分子质量不明确时,可用沉降系数对其特性进行初步描述,以示区别,如4SRNA、10SRNA、23SRNA中4SRNA的粒子最小。PAGE电泳也能反映相对分子质量的不同。相对分子质量小者,粒子的直径较小,在电场中泳动速度就快,反之则慢。不同粒子在同一