高效液相色谱法测定藤茶组织培养后不同组织中二氢杨梅素的含量

高效液相色谱法测定藤茶组织培养后不同组织中二氢杨梅素的含量

藤茶俗称茅岩草莓茶、端午节茶和藤班茶。它的学名是a.g洛斯代特。这是葡萄科，蛇葡萄属于木质藤本植物。它是粤蛇葡萄(A.cantoniesi)的变种,主要分布于广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省。藤茶中主要活性成分二氢杨梅素在该植物幼嫩芽头部位含量最高。二氢杨梅素(3,5,7,3′4′5′-六羟基-2,3双氢黄酮醇dihydromyricetin,DMY)是一种多酚羟基双氢黄酮醇,又称蛇葡萄素,属黄酮类化合物。二氢杨梅素除具有黄酮化合物的清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎抑菌等普通特性外,其在解除醇中毒、降低血脂和血糖水平,提高SOD活性以及保肝护肝等方面具有特殊功效,具有明显拮抗Na和高K所致的兔胸主动脉条收缩反应及钙拮抗作用,且毒性低,可作为抗心律失常、心肌缺血、高血压的新型药物。试验采用高效液相色谱法(HPLC)测定藤茶嫩叶、叶片、老叶、果实、愈伤组织、悬浮培养液中二氢杨梅素的含量,重点探讨了愈伤组织培养法生产二氢杨梅素的可行性。1材料和方法1.1试验材料1.1.1紫外可见光检测仪器Agilent1100Series高效液相色谱仪,L27420紫外可见光检测器,BF22002色谱工作站,AL204万分电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。1.1.2试剂二氢杨梅素对照品(色谱级,纯度>98%);甲醇(色谱纯);超纯水;其它试剂均为分析纯。1.1.3愈伤组织的制备供试材料藤条,春天采自湖南省张家界,移栽到湖南农业大学实验基地。9月中旬采集3种叶片,10月底采集果实,均于48℃烘干,粉碎过60目筛备用。愈伤组织培养选择植株生长健状,无病虫害的藤茶叶片、叶柄、茎段、茎尖等作为外植体。取长势良好、无染菌、黑斑较少的愈伤组织,48℃烘干粉碎,过60目筛备用。悬浮细胞培养选择愈伤培养继代3次后,状态疏松、生长速度快的愈伤组织转入到液体培养基中。选择镜检有一定活细胞数量的同批悬浮液过滤,液体混合备用。1.1.4g/l+蔗糖2%+连续工段愈伤诱导培养基:MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.15mg/L+蔗糖2%+琼脂0.7%;继代培养基:MS+2,4-D2mg/L+蔗糖2%+琼脂0.7%;悬浮培养基:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖2%。1.2测试方法1.2.1超声脱气、超声脱气参照周雪仙等方法,C18柱,流动相为甲醇∶水(36∶64),应用前经过0.45μm微孔滤膜抽滤,超声脱气,流速为1.0mL/min;进样时为20μL,柱温30℃;检测波长291nm。1.2.2定量定量测定取二氢杨梅素对照品5mg,加水溶解并定容至50mL,摇匀,即得(0.1mg/1mL),0.45μm微孔滤膜过滤,取20μL进样,面积外标法定量。计算方法:X=[A样×C标×B样/(A标×M)]×100%式中:X——样品中二氢杨梅素含量(%);A样——样品图谱中二氢杨梅素对应的峰面积;A标——对照品图谱中二氢杨梅素对应的峰面积;C标——二氢杨梅素对照品的浓度(mg/mL)为0.1;B样——溶液稀释倍数;M——样品量(mg或mL)1.2.3样品溶液的制备嫩叶、叶片、老叶、果实、愈伤组织各称取样品粉末1g,置250mL三角烧瓶中,加20倍水于97℃水浴30min,10000r/min离心5min,取上清液备用,沉淀重复上述操作两次,合并3次离心后的上清液,10倍95%乙醇沉淀,10000r/min离心5min,留上清液,旋转蒸发浓缩至50mL,精密量取浓缩液1mL,根据预作试验分别定容到适当体积。超声30min,取适量用0.45μm微孔滤膜过滤即得样品溶液,取20μL进样分析。细胞悬浮液量取200mL,10倍95%乙醇沉淀,10000r/min离心5min,留上清液,旋转蒸发浓缩50mL,精密量取浓缩液1mL,定容到5mL。超声30min,取适量用0.45μm微孔滤膜滤过即得样品溶液。取20μL进样分析。2结果与分析2.1出峰时和出峰时由图1可知,二氢杨梅素对照品大约在7.5min开始出现峰,大约在8.5min时出峰,响应时间7.828min,峰面积为3849165,高度为268796。即A标为3849165,C标为0.1mg/mL。2.2叶氢杨树叶片二氢杨树叶片的光反应将1.2.3中量取的1mL溶液定溶到10mL,然后过膜上样。由图2可知,嫩叶二氢杨梅素响应时间7.902min,峰面积A样为19652356,高度为1102075。稀释倍数B样为50×10=500,求得X,即嫩叶中二氢杨梅素含量为25.528%。2.3叶氢杨树叶片二氢杨树叶片二氢杨树叶片二氢虾素合成的日变化将1.2.3中量取的1mL溶液定溶到5mL,然后过膜上样。由图3可知,叶子二氢杨梅素响应时间7.944min,峰面积A样为21106641,高度为11589752。稀释倍数B样为50×5=250,求得X,即叶片中二氢杨梅素含量为13.709%。2.4老叶二氢杨方面积的响应将1.2.3中量取的1mL溶液定溶到50mL,然后过膜上样。由图4可知,老叶二氢杨梅素响应时间7.980min,峰面积A样为2053457,高度为144301。稀释倍数B样为50×50=2500,求得X,即老叶中的二氢杨梅素含量为13.337%。2.5果实二氢杨树叶片抗氧化能力的测定将2.1.4中量取的1mL溶液定溶到5mL,然后过膜上样。由图5可知,果实二氢杨梅素响应时间7.936min,峰面积A样为9630913,高度为649830。稀释倍数B样为50×5=250,求得X,即果实中二氢杨梅素含量为6.255%。2.6愈伤二氢杨树叶片愈伤二氢杨树叶片的响应时间将1.2.3中量取的1mL溶液定溶到10mL,然后过膜上样。由图6可知,愈伤二氢杨梅素响应时间7.999min,峰面积A样为8942537,高度为592680。稀释倍数B样为50×10=500,求得X,即愈伤中二氢杨梅素含量为11.616%。2.7峰面积及高度由图7可知,悬浮液二氢杨梅素响应时间8.027min,峰面积A样为255303,高度为11440。稀释倍数B样为50×5=250,因为悬浮液是取的200mL,所以M是200,求得X,即悬浮液中二氢杨梅素含量为0.829%。3诱导分化能力试验结果表明,愈伤组织中二氢杨梅素含量与叶子中二氢杨梅素含量接近,可能是生长力旺盛的组织合成二氢杨梅素能力强,而