温州市区小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核及精子畸形研究

温州市区小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核及精子畸形研究

近年来，随着汽车数量的增加，温州的流动污染逐渐成为主要水源。汽车尾气是成分极其复杂的混合物,含有上千种化学物质;可分为CH、CO、NOX、SO2等组成的气体和碳黑、焦油、重金属构成的颗粒物。其中多环芳烃化合物(PAHS)是现代化大城市中环境空气污染的主要成分之一。汽车尾气的排放使污染日益严重,对人类特别是执勤交警的健康带来不同程度的损害。研究表明汽车尾气中的氧化氮能使呼吸疾病恶化。有关用整体动物进行现场染毒实验来研究交通污染物对遗传效应影响的报道甚少,笔者用清洁级ICR小鼠进行了该方面的研究,以探明温州市区交通性污染物对小鼠的致突变性,为该市的环境污染治理提供科学依据。1材料和方法1.1材料表面实验动物为纯种同代健康雄性清洁级ICR小白鼠,共30只,体重约12～15g,由温州医学院实验动物中心提供。1.1.1染毒现场选择根据对温州市各主要交通路口污染程度的初步估测,选择了防空洞、望江路2个点作为染毒现场;选择温州医学院实验动物中心的清洁级动物室作为阴性对照现场,进行交通性污染物对小鼠致突变性研究。1.1.2动物观察和评价实验小鼠随机分为3个组,每组10只。组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为阴性对照组(医学院实验动物中心)、望江路、防空洞。每天上午8点将动物放置各处理现场,下午6点将动物从现场取回,每天接触10h,连续35d。各组动物均采用自由进食和饮水。1.2精子活力测定剪开阴囊,取出睾丸,称重。然后分离出2只附睾,用生理盐水冲洗,放入盛有4ml生理盐水的小烧杯中,以眼科剪剪碎组织,混匀。将一部分的培养液倒置显微镜下进行精子活力观察,把精子分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级;另一部分的精子培养液通过4层擦镜纸滤除组织碎片,滤液经1000r/min离心5min,吸去上清液,剩余少量液体与沉淀摇匀,制片4张。干燥后,甲醇固定5～10min,改用石炭酸品红染色1h。在高倍镜下检查精子形态,每只小鼠检查完整不重叠的精子1000只。凡出现双头或者头部无钩、香蕉状、无定形、肥胖以及双尾、尾巴折叠等现象即定义为畸形,每组观察10000个精子,以求出畸形率(‰)(图1)。1.3小鼠血清中总总糖含量ld50的检测小白鼠脱颈椎处死,取两侧股骨并将其剃净,将股骨置于2ml生理盐水中,用止血钳夹碎,将上层细胞悬液倒入离心管中,弃骨碎片,然后以1000r/min将细胞悬液离心5min,弃上清液,加2～3滴小牛血清(已灭活),每只小白鼠涂片4张,在空气中自然干燥,放入盛有甲醇的染色缸中固定5～10min,取出自然凉干,用1∶10Giemsa磷酸冲液染色10min,缓冲液冲洗,自然干燥。油镜下观察,每只小鼠1000个PCE细胞,计算其微核千分率。1.4统计方法采用SPSS10.0数据处理系统进行方差分析。2结果2.1精子密度、精子重量交通污染物对小鼠精子密度和睾丸重量的影响见表1。从表1可知,组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的精子密度分别为(6.89±0.96)×106/ml、(6.55±1.16)×106/ml、(5.33±0.56)×106/ml。组Ⅲ的精子密度与组Ⅰ、Ⅱ的比较差异均极显著(P<0.001),组Ⅱ与组Ⅰ则差异不显著(P>0.05)。组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的睾丸重量分别为(0.140±0.0076)g、(0.141±0.0060)g、(0.125±0.0056)g。组Ⅲ的睾丸重量与组Ⅰ、Ⅱ的比较差异均极显著(P<0.001),组Ⅱ与组Ⅰ则差异不显著(P>0.05)。2.2组、、、、的精子更新情况,见表1交通污染物对小鼠精子活力影响见表2。由表2可见,组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Ⅰ级精子分别为(19.70±2.06)%、(19.60±2.07)%、(10.80±0.79)%,组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Ⅱ级精子分别为(18.80±2.30)%、(18.70±2.45)%、(13.50±1.08)%,组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Ⅲ级精子分别为(20.00±3.16)%、(19.90±2.69)%、(30.60±1.90)%,组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Ⅳ级精子分别为(42.20±3.77)%、(42.50±3.24)%、(45.10±1.91)%。组Ⅲ的Ⅰ级、Ⅱ级及Ⅲ级精子的百分率与组Ⅰ、Ⅱ的比较差异均极显著(P<0.001),组Ⅱ与组Ⅰ则差异不显著(P>0.05)。2.3、、之间的差异表1交通污染物诱发小鼠精子的畸形率见表3。从表3可见组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的精子畸形率分别为(33.70±8.07)‰、(34.70±3.47)‰、(81.20±9.00)‰。组Ⅲ与组Ⅰ、Ⅱ之间差异均极显著(P<0.001),组Ⅱ与组Ⅰ则差异不显著(P>0.05)。各组出现的精子畸形的类型包括:无钩、香蕉形、无定形、胖头、尾折叠、双头以及双尾等,其中以无钩、无定形为主。2.4正常小鼠的pce微核试验交通污染物诱发小鼠PCE的微核率见表4。从表4可知,组Ⅰ(阴性对照组)的自发微核率为(1.00±0.82)‰,这与文献报道的正常小鼠的PCE微核率非常接近。组Ⅱ、Ⅲ的微核率分别为(1.10±0.74‰)、(6.60±0.70)‰,组Ⅲ与组Ⅰ、Ⅱ之间差异均极显著(P<0.001),组Ⅱ与组Ⅰ则差异不显著(P>0.05)。3小鼠精子畸形率检测(1)大量研究表明,汽车尾气具有很大的致突变效应,且发现其中还有放射物存在。本实验结果显示:温州市区防空洞的交通污染物具有明显的致突变效应,而望江路的则无明显的致突变效应。微核试验表明防空洞(组Ⅲ)微核率>望江路(组Ⅱ)微核率>对照组(Ⅰ)微核率,组Ⅲ与Ⅰ差异极显著,但组Ⅱ与组Ⅰ差异不显著。这说明交通污染物能引起有丝分裂过程中个别染色体活动异常或染色体断裂,进而形成微核,使小鼠PCE微核率增加。(2)精子畸形率试验结果表明:防空洞(组Ⅲ)精子密度及睾丸重量分别<望江路(组Ⅱ)精子密度及睾丸重量<对照组(Ⅰ)精子密度及睾丸重量,组Ⅲ与Ⅰ组差异极显著,但组Ⅱ与组Ⅰ差异不显著;防空洞的Ⅰ级、Ⅱ级精子数均<望江路的<对照组(Ⅰ)的,组Ⅲ与Ⅰ组差异均极显著,但组Ⅱ与组Ⅰ差异不显著;防空洞(组Ⅲ)精子畸形率>望江路(组Ⅱ)精子畸形率>对照组(Ⅰ)精子畸形率,组Ⅲ与组Ⅰ差异极显著,但组Ⅱ与组Ⅰ差异不显著。以上说明交通污染物干扰了精子的发育与成熟,导致精子的畸形率增高,出现无钩、香蕉形、无定形、胖头、尾折叠、双头以及双尾等,其中以无钩、无定形为主。防空洞组的微核率、精子密度、睾丸重量、精子活力及精子畸形率均与对照组差异极显著,说明防空洞的交通污染较严重,具有明显的致突变效应;而望江路组的微核率