米曲霉产蛋白酶的培养基优化研究

米曲霉产蛋白酶的培养基优化研究

美曲霉具有丰富的酶系统，可产生酸性、中性和碱性酶。它稳定性高，能在高耐候性条件下工作。广泛应用于食品、药物和食品等行业。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。国内外已有关于米曲霉蛋白酶特性及米曲霉产酸性蛋白酶适宜条件的研究报道,但米曲霉产中性蛋白酶的适宜条件方面的研究还未见报道。为建立利用米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶的技术,笔者通过对菌株的初筛及培养基组成和发酵条件的研究,提高了米曲霉产中性蛋白酶的能力。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒米曲霉(Aspergillusoyrzae)来自于广东省微生物研究所。1.1.2基础培训1.1.2.酵母膏和khpo葡萄糖2g,蛋白胨1g,牛肉膏1g,酵母膏0.15g,MgSO40.1g,K2HPO40.2g,蒸馏水100mL,琼脂1.5g,pH6.5～7.0。1.1.2.2.固体发酵培养基m豆皮m(豆粕粉)∶m(水)=3∶2∶5,pH6.0～7.0(自然pH)。1.2主要原材料和设备1.2.1特效药除酪蛋白为生化试剂,Folin-酚试剂自己配制外,其他药品均为分析纯试剂。麦麸、豆粕为市购。1.2.2仪器752紫外光栅分光光度计、数显恒温水浴锅、超净工作台、恒温培养箱、手提式高压灭菌锅、ORION710型精密pH计等。1.3方法1.3.1粗酶液的提取准确称取1g搅匀的培养物于研钵中,加入一定量的pH3.0或pH7.2或pH10.0的缓冲液,研匀,置30℃恒温培养箱中抽提30min,每10min搅动一次,最后用4层纱布过滤,滤液即为粗酶液,适当稀释后用于酶活力测定(pH3.0缓冲液为乳酸-乳酸钠缓冲液,pH7.2缓冲液为磷酸缓冲液,pH10.0缓冲液为硼砂-氢氧化钠缓冲液)。1.3.2酪氨酸活力单位采用Folin酚法。40℃下,每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位U,酶活力单位由公式u=kAn4/10计算。式中,u,酶活力单位;A,吸光度;k,吸光度为1.000时对应的酪氨酸质量浓度;n,总稀释倍数;反应体积为4mL,反应时间为10min。2结果与讨论2.1线性范围在λ=680nm时,酪氨酸浓度在0～100mg·L-1范围内,线性关系良好。其回归方程为A=0.0119C+0.023(n=8),r2=0.999,k=82.1。标准曲线见图1。2.2最产酶活力测定米曲霉产生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶,其中主要产生中性和碱性两种蛋白酶。在培养24h时各种蛋白酶酶活力仍然很低,然后随着培养时间的增加,而逐渐增加到一个峰值后,就开始逐渐降低(图2)。峰值即表示在该条件下,达到最高产酶量所需的时间和最大酶活力。产酸性蛋白酶的最适时间为48h,产中性蛋白酶的最适时间为60h,产碱性蛋白酶的最适时间为54h。2.3不同生长温度对米曲霉产酶的影响不同温度条件下培养的米曲霉,其酶活力测定结果见表1。结果表明,在接种量和培养条件完全一致的情况下,培养温度为30℃时,酶活力最高。因此,认为30℃为该米曲霉的最适培养温度。在培养过程中发现,20、25、40、45℃的培养基上见白色菌丝,25、40℃培养的培养基上偶见绿色孢子,而30、35℃培养的培养基上则布满了绿色孢子。因此,可以判定20、25、40、45℃时由于生长温度不适,米曲霉生长不好,造成产酶较少,酶活力较低;35℃时,米曲霉虽然生长较好,但不利于米曲霉产酶,另外温度较高,酶的稳定性也下降,造成酶活力较低。方差分析结果也表明培养温度对米曲霉产酶能力有显著的影响(P<0.05),多重比较结果显示,20℃和35℃间差异不显著(P>0.05),其余各组间差异显著(P<0.05)。2.4培养基起始ph值对酶活力的影响不同起始pH值的发酵培养基培养的米曲霉(用NaOH或HCl调节)的酶活力测定结果见表2。结果表明:培养基起始pH值适宜范围为6～7,在pH为6.0时酶活力最高。方差分析结果表明培养基起始pH值对米曲霉产酶能力有显著的影响(P<0.05),多重比较结果显示,pH为5.0、8.0和9.0组间差异不显著(P>0.05),其余各组间差异显著(P<0.05)。2.5培养基总酶活力测定用水分含量不同的发酵培养基培养米曲霉,酶活力测定结果见表3。从表3可看出,在加水量为5.0mL,即培养基的水分质量分数为50.0%时,其单位酶活力最高,达1489.2U·g-1。在加水量为7.5mL,即培养基的水分质量分数为60.0%时,其总酶活力最高,达17681U。因此,认为培养基最适的水分质量分数为50.0%～66.7%。方差分析结果表明,水分对米曲霉培养物的单位酶活力有显著的影响(P<0.05),多重比较结果显示,加水量为5.0mL和7.5mL组间差异不显著(P>0.05),其余各组间差异显著(P<0.05);水分对米曲霉培养物的总酶活力有显著的影响(P<0.05),多重比较结果显示,加水量为10.0mL和7.5mL组间差异不显著(P>0.05),其余各组间差异显著(P<0.05)。2.6pahs对产酶的影响发酵培养基中添加各种无机盐对产酶影响的测定结果见表4。从表4可以看出,KNO3和MgSO4对米曲霉产生中性蛋白酶有明显的促进作用,其相对酶活力分别达152.9%、146.3%。Na2HPO4和(NH4)2SO4对产酶也有一定促进作用,K2HPO4、CaCO3、KH2PO4和ZnSO4对产酶的影响不大,而FeSO4对产酶有明显的抑制作用,其相对酶活力仅为68.7%。方差分析结果表明,添加无机盐类后对米曲霉产酶能力有显著的影响(P<0.05),多重比较结果显示,添加KNO3、MgSO4、Na2HPO4和(NH4)2SO4与对照组间差异显著(P<0.05),添加其他无机盐组与对照组间差异不显著(P>0.05)。2.7接种量对产酶的影响接种量对产酶的影响测定结果见表5。结果表明:接种量对产酶的影响很大,随着接种量增加,酶活力不断增加,在接种量为每10g培养基1×108个孢子时产酶活力最高,但当接种量继续增加时,酶活力反而有所下降,可能是由于接种量太大,营养缺乏,抑制了蛋白酶的产生。方差分析结果表明接种量对产酶能力有显著的影响(P<0.05),多重比较结果显示,各实验组与接种量为1×108组间差异显著(P<0.05)。2.8培养基的浓度在自然通风条件下,不同培养基组成下米曲霉产蛋白酶的测定结果见表6。结果表明:当培养基中m(麸皮)∶m(豆粕)为4∶1时,酶活力最高,并随着豆粕的含量增高,酶活力反而下降,培养基全为麦麸时,酶活力仍较高。可能与培养基的碳氮比有关,以及与豆粕为粉状制成培养基时,透气性较差,而麦麸为薄片状,制成培养基时,透气性较好有关。方差分析结果表明培养基组成对米曲霉产酶能力有显著的影响(P<0.05),多重比较结果显示,m(麸皮)∶m(豆粕)为1∶4和2∶3,4∶1和5∶0组间差异不显著(P>0.05),其余各组间差异显著(P<0.05)。2.9中性蛋白酶的最佳培养温度优化条件后米曲霉产中性蛋白酶的产酶曲线见图3。从图3可看出,在最适培养条件下,米曲霉产中性蛋白酶的量达到了3999.2U·g-1,比实验初期的1103.4U·g-1提高了2倍多,达到最高酶活力的时间也由原来的60h提前到了48h。3中性蛋白酶的培养综上所述,米曲霉产中性蛋白酶的适宜培养条件为:m(麸皮)∶m(豆粕粉)=4∶1,水分质量分数为60%,培养基中各无机盐质量分数为:KNO30.2%,MgSO40.05%,Na2HPO40.13%,pH值为6.0,接种量为每10g培养基接种1.0×108个孢子,最佳培养温度为30℃,最佳培养时间为48h。在此培养条件下,最高酶活力达3999.2U·g-1,比吴虹在培养基中添加植酸质时培养泸酿3.042号米曲霉的最高酶活力3588U·g-1稍高,但低于邱雁临等利用米曲霉AOI