影响糖跨膜转运的因素

影响糖跨膜转运的因素

糖是生物因素的基本养分和主要组成组成，也是最重要的能源和碳源。糖在生物体内转运方向和转运速率都受到严格的调节,这种调节与介导糖跨膜运输的转运系统有关,其分别由糖转运蛋白家族和非糖转运蛋白家族成员构成。糖转运蛋白属于主要易化子超家族(majorfacilitatorsuperfamily,MFS),依据被转运糖的种类,主要分为单糖转运蛋白(monosaccharidetransporter,MST)和二糖转运蛋白(disaccharidetransporterDST)。单糖转运蛋白主要负责葡萄糖、果糖等己糖以及戊糖的转运,在生物体内广泛存在;二糖转运蛋白主要介导蔗糖的运输,为高等植物所特有。它们二者在氨基酸序列上具有同源性,在蛋白结构上具有相似性。非MFS家族成员构成的糖转运系统包括动物中的Na+-依赖型葡萄糖转运蛋白(SGLT)和细菌中的磷酸转移酶系统(phosphotransferasesystem,PTS)。研究表明,糖的跨膜转运,不仅受糖转运系统构成蛋白编码基因表达的调节,其转运方向和速率还受糖转运系统构成蛋白之间以及与其他蛋白质的相互作用调节,揭示这种互作机制及其对糖跨膜转运的影响,将有助于阐明糖运输的调节机理以及糖对生物生长发育的能量供应规律和调节功能,并为阐明糖代谢缺陷发生机制提供思路。1动物粘膜糖转移系统中的蛋白关系1.1glut及其衍生物的基因检测在哺乳动物细胞中,葡萄糖进入细胞可以借助两种不同的转运系统:葡萄糖易化扩散转运蛋白(GLUT)和Na+-依赖型葡萄糖转运蛋白(SGLT)。GLUT对D-葡萄糖具有专一性,转运过程中不伴随能量的消耗。GLUT有12个跨膜结构域,迄今为止,在哺乳动物组织中至少发现了14种由不同基因编码的GLUTs,依次命名为GLUT1~14。SGLT则以主动方式逆浓度梯度转运葡萄糖(SGLT1和SGLT2),有的SGLT蛋白不仅行使糖转运的功能,还是糖感受器(SGLT3)。SGLT不属于MFS家族,在一、二级结构上与GLUT和植物的单糖转运蛋白几乎没有同源性,但是它们对糖的转运机制可能相似。GLUT蛋白由多基因家族编码,其成员在底物特异性、转运活性、发育和组织特异性以及对环境的响应方面存在差异,调节方式也是多水平和多机制的,如转录、翻译和蛋白互作调节等。属于MFS的膜蛋白可以通过寡聚化形成同源二聚体、异源二聚体、甚至四聚体来调节转运活性。SGLT蛋白家族已经发现230多种蛋白,其中在人类中有11种。1.2glut1和同源二聚体对d-葡萄糖、d-糖的检测能力研究表明,生物膜上的GLUT1可以单体、二聚体、四聚体或与其他蛋白的聚合体形式存在。HEBERT利用脂质双分子层化学交联法研究证明人细胞膜上的GLUT1在二硫苏糖醇有(+DTT)和无(-DTT)的条件下,可以分别形成同源二聚体和同源四聚体。利用结构特异性抗体(抗GLUT1-DTT抗体,α-IgGs)对人红细胞进行的实验表明,在无DTT的条件下,膜上的GLUT1均为同源二聚体。他还发现同源二聚体与同源四聚体对D-葡萄糖的识别能力有所差别,前者只有一个D-葡萄糖的识别位点,而后者则至少有2个。另外,二者对细胞松弛素B的识别能力也存在区别。细胞松弛素B是一种蛋白抑制剂,它可以与GLUT1跨膜区域10和11上的第388位和412位的色氨酸结合,抑制葡萄糖的运输。研究证实,同源二聚体对细胞松弛素B的识别能力只有四聚体的一半。以上均表明GLUT1的寡聚体结构可以影响它的功能特性。1.3动物细胞膜糖转移系统的蛋白质与其他蛋白质的互用性1.3.1蛋白质相互作用14-3-3是一个高度保守的酸性蛋白质家族,其成员的相对分子质量约为25~30kD。它们通过与靶分子结合改变其构象,从而达到调节靶分子定位、活性或稳定性的作用。迄今为止,已经发现它们与200多种蛋白质存在相互作用,参与物质代谢、基因表达、信号转导、蛋白质定位与运输等的调节。张旭等利用交联以及免疫印迹分析发现14-3-3蛋白可以与GLUT4发生免疫共沉淀。在大鼠脂肪细胞中,14-3-3蛋白与GLUT4之间具有相互作用。研究者们推测:当GLUT4被核内体从细胞膜内吞到细胞质后,14-3-3蛋白与之结合使它被限制在某个特定区室中,而当14-3-3蛋白从GLUT4解离后,GLUT4就能够重新定位到储存结构或行使功能的膜上,并获得受胰岛素调节的敏感性,然而其作用方式和细节目前仍不清楚,需要进一步的研究。1.3.2糖蛋白与钙连接蛋白钙联蛋白(Calnexin)和钙网蛋白(Calreticulin)构成了内质网内蛋白质折叠和装配的重要监控系统。这个系统能够专一地识别以N2糖苷键连接的糖蛋白,保证只有正确折叠的糖蛋白才能到达它们行使功能的场所。MARGOLESE等和DEGEN等利用交联反应发现,糖转运蛋白与钙联接蛋白可在体外发生互作。OLIVER等以GLUT1的N末端155个残基片段(GT155)为靶蛋白(这个结构包含了N端糖基化的位点),利用抗钙联接蛋白抗血清进行免疫共沉淀,发现GT155与钙联蛋白以及钙网蛋白均能发生互作。但同时也发现GT155的突变体AGGT155,由于45位的天冬氨酸发生突变而不能被糖基化,因而不能与上述蛋白发生免疫共沉淀,这个结果说明GT155-钙联蛋白以及GT155-钙网蛋白之间的互作都依赖于GLUT1的糖基化。1.3.3glut1在脂种及其产物的作用脂筏(lipidrafts)在绝大多数哺乳动物细胞质膜都有分布,一般大小为5~300nn,是生物膜不被去垢剂所溶解的部分。脂筏有一些特有的内在结构蛋白,stomatin就是其中的一类。BLONDER等用去垢剂处理红细胞膜得到抗去污剂脂筏(detergent-resistantlipidrafts,DRMR)组分,其中发现存在GLUT1。研究表明GLUT1结合在脂筏的永久蛋白stomatin上。利用GLUT1的单克隆抗体对人红细胞膜蛋白进行免疫共沉淀,经Westernblot检验发现stomatin被沉淀出来。同样,利用stomatin的抗体也可以从人红细胞膜蛋白中免疫共沉淀出GLUT1。相同的反应也存在于大鼠肝的克隆9细胞中。此外,利用葡萄糖转运蛋白抑制剂细胞松弛素B降低了细胞对葡萄糖的吸收速率,同时发现stomatin的表达上升,这个结果间接说明它们之间是存在相互作用的。1.3.4mubc9突变体的构建mUbc9是一段约20kD的蛋白,可在小鼠的骨骼肌、心脏、肝脏及肾组织的提取物中检测到,是泛素交联酶E2的类似物,其特异结合底物蛋白是Sentrin(一种类泛素蛋白)。GIORGINO等利用酵母双杂交系统发现,mUbc9通过一段11个氨基酸序列直接与GLUT4及GLUT1胞内C末端区域结合,介导GLUT4及GLUT1与mUbc9的底物蛋白sentrin结合。mUbc9与葡萄糖转运蛋白的结合得到了体外实验的证实。他们将mUbc9与谷胱甘肽转移酶(glutathioneS-transferase,GST)的融合蛋白GST-mUbc9固定于谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠上,加入小鼠L6肌母细胞的融解胞内膜或原生质膜进行培养,抗体检测表明GST-mUbc9复合体可以与GLUT4和GLUT1结合,单独的GST不能与它们结合,也检测不到mUbc9与GLUT3之间的互作,说明这种结合具有特异性。mUbc9在小鼠L6肌母细胞中的过表达导致GLUT1的数量减少65%,并降低葡萄糖的基础转运,但GLUT4的数量却增加了8倍,受胰岛素刺激的葡萄糖转运也得到增强。没有活性的mUbc9突变体mUbc9-Ala93则产生相反的效应:GLUT1数量增加,葡萄糖的基础吸收水平升高;GLUT4数量减少,胰岛素刺激的葡萄糖吸收降低。这些实验表明mUbc9对不同糖转运蛋白的调节具有差异性,促进GLUT1的降解,促进GLUT4的合成,但关于这种调节的机制还未见报道。1.3.5glut1与dematchs1的相互作用人红细胞骨架的核心是由血影蛋白(spectrin)、肌动蛋白(actin)、蛋白4.1(protein4.1)以及adducin和dematin蛋白所组成的血影-肌动蛋白结合复合体。CHEN等发现,缺乏dematin和adducin的突变小鼠在红细胞的构型和稳定性方面有缺陷,并且伴有溶血现象。这些说明二者对于维持红细胞的形状、膜的稳定性有重要作用。他还推测dematin和adducin可能作为接头蛋白通过另一种跨膜受体蛋白,把连接复合体与细胞膜相连,并猜测GLUT1就是这种受体蛋白。KHAN等将全长dematin(48kD)与GLUT1瞬时转染人类胚胎肾脏的上皮细胞,通过单克隆抗体免疫沉淀dematin,得到的dematin免疫复合物再与GLUT1的多克隆抗体进行Western杂交,结果发现了GLUT1的存在,说明GLUT1与dematin发生了互作。为了验证GLUT1是否也能单独与adducin发生互作,他们又构建了用FLAG(氨基酸序列为DYKDDDDK)标记的人类全长β-adducin,并与GLUT1在人类胚胎肾脏的上皮细胞中共同表达。当用抗-FLAG抗体对β-adducin进行免疫沉淀时,发现大量的GLUT1也被共沉淀下来。这些研究表明,在人红细胞内,dematin和adducin通过与跨膜蛋白GLUT1结合,将血影-肌动蛋白连接复合体与红细胞膜连接起来。1.3.6胞化学检测hsp60与sglt1的互作Hsp70是一种热激蛋白,在猪的肾脏细胞中能够激活SGLT对葡萄糖的转运。IKARI等通过免疫细胞化学方法,检测到Hsp70与SGLT1共同定位于上皮顶端膜(apicamembrane),还发现在ATP缺失的条件下,Hsp70能够与SGLT1免疫共沉淀,这种互作后来也被抗体实验所证实。Hsp70与SGLT1的蛋白复合体不但能够提高SGLT1在上皮顶端膜的表达,还促进了葡萄糖吸收的上调。2植物膜糖转移系统中的蛋白关系2.1植物蔗糖转运蛋白所有植物的单糖转运蛋白都很相似,均为单糖-H+同向转运蛋白,并且表现出MFS成员典型的特征:具有12个跨膜结构域。位于N端的6次跨膜区与C端的6次跨膜区同源性很高,但在一些重要的结构域内部分保守氨基酸并不一致,因此推测在蛋白质结构上的这些差异与底物特异性有关。植物单糖转运蛋白底物范围较广,特异性较差,可以转运己糖和戊糖,最适底物的Km值在10~100mmol·L-1之间。植物单糖转运蛋白,与同是MFS成员的酵母己糖转运蛋白(ScHxts,ScGal2)、哺乳动物葡萄糖转运蛋白(GLUTs)以及植物蔗糖转运蛋白有较高的同源性。植物的二糖转运蛋白主要是蔗糖转运蛋白。蔗糖是植物光合产物运输的主要形式,也是植物许多库组织细胞吸收糖分的主要形式。所以,蔗糖转运蛋白广泛存在于植物各种类型的组织和细胞中。蔗糖转运蛋白具有12个跨膜结构域,其N末端和C末端均位于质膜的细胞质一侧,面向细胞质的中间部分有一突出环将蔗糖载体蛋白分为分别含6个跨膜结构域的两大部分。根据其对底物蔗糖的亲和性及转运能力,蔗糖转运蛋白可聚类为SUT1、SUT2和SUT4三个亚族。SUT1亚族中所有成员均是高亲和力的蔗糖转运蛋白,它们对蔗糖的Km值为139μmol·L-1~1.5mmol·L-1[32-34];SUT4亚族中的成员(除DcSUT1之外)则是低亲和力的蔗糖转运蛋白,它们对蔗糖的Km值为5~6mmol·L-1;SUT2亚族对蔗糖表现出非常低的亲和力和转运能力,或者根本就不行使蔗糖转运的功能,WEISE和BARKER等认为SUT2具有调节功能,可以通过感知蔗糖信号而直接调控SUT1和SUT4的表达、蛋白质折叠及其活性。2.2植物糖转移系统中的蛋白间2.2.1蔗糖转运蛋白寡聚化对蔗糖转运蛋白转运活性的影响目前尚未见到植物单糖转运蛋白形成寡聚体的报道。但是根据动物中的研究结果,以及同是MFS家族的蔗糖转运蛋白寡聚化对蔗糖转运蛋白转运活性有精确调控作用的研究结果,则有理由推测在植物中也存在单糖转运蛋白之间的互作。2.2.2植物细胞膜二糖转移蛋白之间的关系网络2.2.2.酵母双杂交系统为了验证蔗糖转运蛋白之间是否可以形成同源寡聚化,REINDERS等利用了一个改良的酵母双杂交系统。在这个系统中,利用LacZ表达情况来检测蛋白之间的互作。结果表明,LeSUT1和LeSUT2都能分别与自身进行互作,激活β-半乳糖苷酶的转录。2.2.2.sut2对创新蔗糖的转运活性在茄科植物中,SUT1、SUT2和SUT4基因具有重叠表达的模式;REINDERS利用分裂的泛素系统(split-ubiquitin)成功地证实存在于同一筛分子质膜上的3个亚族的蔗糖载体之间可形成二聚体。此外,他们还发现,在酵母中SUT1和SUT2共表达时,SUT2在强启动子驱动条件下,虽然不影响SUT1的表达和准确定位,但使SUT1吸收蔗糖的能力(Vmax)降低10倍,表明SUT2对SUT1转运活性的影响可能发生在转录后或翻译后的修饰水平上。SUT2与SUT1的异源二聚体亲和力是SUT1同源二聚体的1/4,SUT1与SUT4的异源二聚体的亲和力是SUT1同源二聚体的1/2。据推测,SUT2可能作为蔗糖信号的感应器,感知胞内蔗糖的存在或浓度变化,通过调节载体蛋白的周转或启动相关信号的方式来调控SUT1和SUT4基因表达或转运活性,或者通过蛋白质互作直接调节SUT1和SUT4的转运活性。然而,也有实验证据表明SUT1对SUT2的作用没有响应,将SUT1-GFP与SUT2在酵母中共表达时,SUT1对底物的亲和力和转运速率都没有发生变化。在这个实验中,不能排除GFP的存在掩盖了SUT1与SUT2互作的功能结构域,从而影响相互间作用的可能性。不同种类和功能的蔗糖转运蛋白之间的相互作用形成具有不同转运活性的复合体,可能是植物细胞快速调节蔗糖运输的一种重要方式。但是它们的互作方式、机制以及之间是否存在桥梁蛋白目前仍不清楚。2.3化蔗糖水解糖凝剂最佳转化酶系统WESCHKE等认为植物细胞壁转化酶能够催化蔗糖水解而形成葡萄糖和果糖,两者均为单糖转运蛋白的底物,很显然,转化酶和单糖转运蛋白也有相互协作的可能,但目前尚无实验证实。3hx基因家族的转支分子酵母中拥有多种MFS家族的糖转运蛋白,例如,酿酒酵母已经发现21个编码类似于植物己糖转运蛋白的基因(HXT1~HXT17,GAL2,SNF3以及RGT2,RGT1)。其中,RGT和SNF3所编码的葡萄糖运蛋白被证实不具有糖转运能力,而是作为胞外葡萄糖感受器并产生胞内信号,诱导HXT基因的转录;HXT基因家族所编码的转运蛋白HXT1~HXT4,以及HXT6~HXT7被认为是主要的葡萄糖转运蛋白,对HXT8~HXT17的功能研究表明它们与糖的利用没有直接关系;而GAL2编码了一个类似于HXT的半乳糖转运蛋白。目前尚未见到酵母糖转运蛋白间互作的研究报道。4eiii的结构组成在细菌中,糖的吸收机制完全不同于真核生物,它对葡萄糖等单糖的吸收依赖于PTS。该酶系统属于磷酸转移酶家族。在细菌中,细胞外的葡萄糖进入PTS的糖转运通道后被磷酸化,然后以6-磷酸葡萄糖的形式穿过细胞膜。这种己糖转运蛋白与植物单糖转运蛋白几乎没有序列同源性。细菌的PTS是一个多蛋白构成的复合体,包括EI、HPr和EII蛋白。EII构成糖过膜的通道并将糖磷酸化,HPr是EII的磷酸基团的供体,EI是PEP脱磷酸化的受体和HPr的磷酸供体。EII复合体由3个功能区域(A,B,C)组成:C区有6个跨膜结构域,形成糖转运的通道;B区位于膜的细胞质一侧,有一个半胱氨酸残基端,负责为进入通道的糖提供磷酸基;A区是B区半胱氨酸残基的磷酸基供体,同时也是来自HPr的磷酸基受体。在E.coli中,EI首先被PEP脱下的高能磷酸基磷酸化,然后EI将磷酸基传递给HPr的N末端15位组氨酸,后者将磷酸基传递给EII;从细胞膜外进入PTS复合体通道的单糖被磷酸化,形成6-磷酸葡萄糖,进入细胞质