亚型sk2通道与肌浆网ryr2蛋白在小电导ca

亚型sk2通道与肌浆网ryr2蛋白在小电导ca

电导率ca2的激活通道k+（小电导率calius通道，sk）有四种不同的亚类型，即sk1、s2、s3和s4通道。人和小鼠的心肌组织存在SK2通道,参与心肌细胞动作电位(actionpotential,AP)复极化的构成。SK通道是依赖于细胞内Ca2+激活的K+通道,其钙源主要来自细胞膜L-Ca2+通道,部分可能与肌浆网(ryanodinereceptor,RyR),即Ca2+释放通道有关。作者之前的工作首次验证了心肌SK2通道与RyR2(心脏RyR型受体)为一功能复合体,具有相互作用。为进一步探讨SK2的功能,作者采用酵母双杂交系统检测了SK2蛋白与RyR2蛋白之间是否存在直接相互作用,报道如下。1材料和方法1.1菌株和菌株酵母菌株AH109、酵母表达载体pGBKT7及pGADT7、酵母培养基YPD、缺陷型培养基SD/-Trp-Leu和SD/-Trp为Clontech公司产品;DH5α大肠杆菌菌株为郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室保存;含有完整的小鼠RyR2cD-NA质粒由Ray博士(加拿大卡尔加里大学)惠赠;含有完整的小鼠SK2cDNA质粒购自OriGeneTechnologies公司。1.2分子质量和凝胶回收纯化试验TaqDNA聚合酶、dNTP和质粒小量提取试剂盒购自Promega公司;EcoRⅠ内切酶、NdeⅠ内切酶、BamHⅠ内切酶、T4DNA连接酶和X-α-Gal购自TaKaRa公司;凝胶回收纯化试剂盒购自Axygen公司;常规分子生物学试剂为国产分析纯或进口分装。1.3ryr2蛋白结构域及引物的筛选使用DNASTAR、DNASIS和VectorNTIAdvance等软件,并参考文献综合分析SK2蛋白结构域,将SK2分为3个片段,分别包含N-末端、C-末端和跨膜区。参阅文献综合分析RyR2蛋白结构域,将RyR2分成16个片段。根据GenBankSK2基因(IDBC125475)和RyR2基因序列(IDNM023868)分别设计引物,由上海博兴生物公司合成。采用PCR扩增、胶回收纯化RyR216个目的基因片段和SK23个目的基因片段,分别与T载体连接,形成重组子转化DH5α,对筛选出的阳性克隆进行DNA测序分析。1.4重组ryr2基因片段与线性双黏pgadt7载体的关系将3个SK2双黏目的基因片段分别与线性双黏pGBKT7载体重组;将16个RyR2双黏目的基因片段分别与线性双黏pGADT7载体重组。重组子pGBKT7-SK2用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切鉴定,pGADT7-RyR2用EcoRⅠ、BamHⅠ/NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。1.5感受态酵母细胞的培养从YPDA平板上挑取AH109单克隆,接入YPDA液体培养基,经重悬、洗涤及离心沉淀获得感受态酵母细胞。分别将pG-BKT7-SK2和pGADT7-RyR2电转化感受态酵母细胞AH109,涂布X-α-Gal/SD/-Trp平板培养。蓝色菌落表明对酵母细胞有激活能力。1.6感受态酵母的诱导诱导酵母菌群落生长将3个酵母表达载体pG-BKT7-SK2分别与16个表达载体pGADT7-RyR2进行组合,两两配对(共48对),采用山梨醇电转化法将48个配对分别转化入感受态酵母AH109,点于X-α-Gal/3-AT/SD/-Trp-Leu固体培养基,30℃倒置培养3d。同时以含有pGBKT7-53/pGADT7-T的酵母菌AH109点种作为对照。若上述转化酵母菌落生长且变蓝,说明转化子之间有相互作用;若为白色菌落生长,说明两转化子转入核内,但无相互作用。2结果2.1阳性克隆测序经PCR扩增,获得3个SK2目的基因片段,分别为411、729和546bp。将3个目的基因分别克隆至T载体,转化E.coliDH5α,筛选出的阳性克隆测序结果与GenBank中报道的SK2序列一致。3个重组子与pGBKT7连接,经酶切鉴定,得到重组酵母表达载体pGBKT7-SK2441、pGBKT7-SK2729和pGBKT7-SK2546(图1)。2.2表达阳性克隆经PCR扩增,获得16个RyR2目的基因片段:1159、1166、1186、1203、1062、814、1235、1693、1070、1104、1049、662、870、1006、845和684bp。分别将16个RyR2目的基因片段亚克隆至T载体,转化E.coliDH5α,经酶切筛选阳性克隆测序,结果与GenBank报道的RyR2序列完全一致。将16个重组子RyR2-T所含的目的基因片段分别克隆到pGADT7酵母表达载体,经PCR和酶切鉴定获得重组质粒:pGADT7-RyR21159、pGADT7-RyR21166、pGADT7-RyR21186、pGADT7-RyR21203、pGADT7-RyR21062、pGADT7-RyR2814、pGADT7-RyR21235、pGADT7-RyR21693、pGADT7-RyR21070、pGADT7-RyR21104、pGADT7-RyR21049、pGADT7-RyR2662、pGADT7-RyR2870、pGADT7-RyR21006、pGADT7-RyR2845和pGADT7-RyR2684(图2)。2.3adt7-ryr2和pg-bkt7-sk2的相互作用AH109于X-Gal缺陷型培养基上无蓝色菌落生长。pGADT7-RyR2/pG-BKT7-SK2配对分别转化入酵母AH109,48个培养组菌落均为白色,而对照菌落为蓝色,说明SK2蛋白与RyR2蛋白之间无直接相互作用。3酵母双杂交系统论检测结果SK2通道是位于细胞膜上的K+通道蛋白,通过膜电位与Ca2+整合而参与AP的构成,影响AP复极化末期,而此期相当于心肌细胞兴奋性的相对不应期和超常期,涉及临床心律失常发生的重要机制。然而,对心肌SK通道的作用机制及其相关分子,少有报道。作者前期工作表明,天然心肌组织中SK2与RyR2之间可能具有相互作用,为进一步探讨2者间是否存在直接相互作用,该研究以酵母双杂交系统进行了检测。作者首先采用酵母双杂交系统对SK2与RyR2蛋白之间的相互作用进行了初步的探讨。经PCR扩增3个SK2和16个RyR2目的基因片段,成功构建了酵母表达质粒pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2。作者所采用的酵母菌株AH109含有3种报告基因:Ade2、His3和Mel1(或LacZ),研究中应用X-α-Gal来检测报告基因的激活情况。结果表明酵母表达质粒本身不具有自激活效应,故可用于该双杂交系统模型。酵母双杂交实验结果表明SK2与RyR2蛋白之间并没有直接相互作用。酵母双杂交系统是一种在真核细胞酵母内检测蛋白与其他研究蛋白相互作用的方法,得到的结果可能与天然情况相似。但是,该技术也存在着某些缺陷,它不能检测所有的蛋白与蛋白之间的相互作用。对于在细胞内不能正确折叠以及不能转移到核内的蛋白不能检测。此外,对于那些发生在膜上的相互作用的