生物化学与分子生物学实验技术-第三次(PCR 蛋白纯化)

PCR技术PCR:PolymeraseChainReaction(聚合酶链式反应)一）Concept——PolymeraseChainReactionPCR技术：在试管中模拟细胞内DNA复制的一种DNA快速扩增实验技术方法。1983

美国Cetus公司的KaryMullis于12月16日第一次成功实验发明了PCR；1985

关于PCR的文章首次由KaryMullis及其同事等人在《Science》上发表；1989

美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年；1993KaryMullis，NobelPrizeinChemistry；——PCR技术让DNA的研究得到飞跃发展！1983年4月美国Cetus公司的KaryMullis开始设想二）PCR的发明1944~KaryMullisATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶1.体内DNA的复制过程：三）PCR技术的原理及反应步骤：DNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’引物酶AUCGCG5’引物酶DNA解旋解链合成引物子链延长1.体内DNA的复制过程：ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’3’3’DNA解旋解链合成引物子链延长ATAGCGTAGCTGCGAGGATCGDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’AUCGCG5’3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’GGAUCG5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT1.体内DNA的复制过程：2.PCR反应体系1）模板DNA2）特异引物3）耐热DNA聚合酶4）dNTPs（包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP）5）含Mg+的缓冲液第一步——双链DNA完全变性为单链DNA（95℃）－denature(变性)3.PCR反应过程模板DNA第二步——降温使引物与模板结合形成模板－引物复合物（50～65℃）－annealing(退火)模板DNA模板DNA引物引物第三步（72℃）DNA模板--引物结合物在

DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料合成一条新的与模板DNA互补的链。－elongation(延伸)耐热DNA聚合酶dNTPs模板DNA引物模板DNA引物第一个循环－靶序列完成复制新的DNA新的DNA72℃95℃50-65℃反复循环25-40次变性解链退火(复性)新链合成引物耐热DNA聚合酶+dNTPs

循环次数DNA的链数

1

2122

2243

23810

210102420

220

1,048,57630

230

1,073,741,82410亿

PCR循环次数与DNA产量关系每完成一个循环需1～3分钟，1～2小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。Mg2+dCTPdGTPdTTPdATPTaqDNA聚合酶

Primer4.PCR结果分析：四）PCR技术的特点：1.高度的灵敏性PCR产物每轮循环增加一倍30轮循环扩增量达230个拷贝1）皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2）能从100万个细胞中检出一个靶细胞3）细菌检测的最小检出率为3个细菌DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2.特异性引物引物

(1)引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。

(2)引物设计的最大原则:是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。NOTE:3.对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。4.操作简便易行1）一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2）扩增产物一般用电泳分析琼脂糖凝胶电泳五）主要PCR类型：常规PCR技术逆转录PCR(reversetranscription,RT-PCR)技术实时PCR技术原位PCR技术多重PCR技术……….六）PCR技术的应用1.基因克隆可通过PCR技术克隆基因组中

的任一基因。2.临床诊断细菌、病毒、寄生虫检测，遗传病诊断等3.基因定点突变可利用PCR技术随意在体外对目的基因片段进行插入、缺失和点突变改造。4.法医学鉴定亲子鉴定，犯罪现场标本分析5.DNA序列测定扩增目的片段后可装入特定的载体或直接测序。其他……凡是生命科学领域，PCR都有用武之地！小结一）PCR的概念二）PCR的发明三）PCR技术的原理及反应步骤四）PCR技术的特点五）主要PCR类型六）PCR技术的应用SeparationandPurificationofProtein蛋白质的分离和纯化蛋白质是一生物大分子，要研究蛋白质的结构、性质、功能和利用，首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。

分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：1.分子的大小和形状2.酸碱性质3.溶解度4.吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力1.分段盐析蛋白质的盐析（saltingout/saltprecipitation）采用中性盐使混合物中不同蛋白质析出沉淀下来的分离方法。

机制：

1.中和蛋白质表面电荷2.与蛋白质直接争夺水化膜，致使蛋白质水化膜破坏一、蛋白分离常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。血清蛋白球蛋白白蛋白α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白[饱和(NH４)２SO４][半饱和(NH４)２SO４][33%(NH４)２SO４]——分段盐析法分段盐析法：改变中性盐的浓度/pH可使不同的蛋白质分批分次沉淀下来的过程。2．有机溶剂沉淀分离法与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，引起蛋白质沉淀。机制——改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20℃时，80)有机溶剂是低介电常数物质(20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。蛋白质分子表面水化膜破环促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。3.电泳分子大小不同的蛋白质所带电种类不同，净电荷不同，迁移率不同，因此，在电泳时可以分开。1）．密度梯度(区带)离心蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心;质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快;每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带，4.离心蛋白质在离心力场中的沉降行为用沉降系数表示(sedimentationcoefficient,S)，即每单位引力场生物大分子下沉的速度。

利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离S与蛋白质的密度和形状相关。

2）．超速离心4.离心

超速离心法(ultracentrifugation)

在超速离心机中，利用蛋白质密度的不同，应用强大的离心力（≥80000转/分或500000×g）分离、制备、分析蛋白质的方法。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，对于球状蛋白质，其分子量与其沉降系数S成正比。=S未知S标准S未知Mr未知Mr标准二、蛋白纯化

透析(dialysis)：是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸和其他改型的纤维素材料。1．透析

超滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。2.超滤：亲和层析离子交换层析凝胶过滤层析3．层析1）．凝胶过滤层析(分子排阻)3．层析2）.离子交换层析（IonExchangeChromatography，IEC）：——离子交换剂（阳离子/阴离子）——液体固定相：流动相：离子交换层析原理：利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对溶液中各种离子的结和力不同而达到分离目的的一种层析分离技术。以阳离子交换层析为例，阳离子交换树脂颗粒上带负电荷，能吸收溶液中的正离子，再用含阳离子的溶液洗柱，含正电荷少的蛋白质先被洗下来，增加阳离子浓度，含正荷量多的蛋白质也被洗脱下来，从而达到分离的目的。原理：亲和层析(affinit