盐酸美金刚胺及其前药脂水分配系数的测定

盐酸美金刚胺及其前药脂水分配系数的测定

盐酸美金刚胺（mh）是第一个抗癫痫药物，在阿尔茨海默病和血管性迷宫性血管性疾病方面发挥着显著作用。未经批准，它被允许用于中重度ad的治疗。为增加盐酸美金刚胺的脂溶性,提高其通过血脑屏障(BBB)的能力,目前已设计并合成了盐酸美金刚胺前药(PMH),其理化性质未见报道。从化学结构分析可能具有脑靶向性,实际药理药效还处于处于基础研究阶段。现采用恒温摇瓶法测定MH及PMH脂水分配系数,证明PMH比MH具有更高的脂溶性。推测其具有良好的透过BBB的能力,可提高药物在脑内的浓度。1实验部分1.1计成都双港四合开中国LC-10ATvp液相色谱仪系统(日本岛津);PHS-3C型酸度计(成都方舟科技开发公司);盐酸美金刚胺(MH,含量99.5%)及盐酸美金刚胺前药PMH(含量99.1%)(四川大学化学学院);盐酸金刚烷胺(市售);水为重蒸水,其余试剂均为化学纯。1.2方法和结果1.2.1样品背景和检测方法色谱柱为LunaC18(150mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇-水-三乙胺(70:30:0.5,磷酸调pH7);流速为1.0ml·min-1;检测波长为225nm。理论板数按盐酸美金刚胺衍生物峰计算应不低于3×103。盐酸美金刚胺衍生物峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。1.2.2线性相关法取盐酸美金刚胺适量,精密称定,用三氯甲烷制成1mg·ml-1的溶液;取该溶液适量,与磷酸盐缓冲溶液(pH7.8～8.0)混合,置恒温振荡仪(37℃、281r·min-1)上振荡16h后,4℃避光静置2.5h。分取脂水两相溶液,离心,各取1ml,用甲醇稀释至50ml;各取10μl,加10μl内标溶液(20μg·ml-1盐酸金刚烷胺甲醇溶液),60℃水浴中挥干,加衍生化试剂(苯甲酰氯丙酮溶液)100μl和三乙胺10μl,混匀,4℃下避光放置30min,60℃水浴中挥干,加100μl流动相溶解后,取20μl进样测定。采用内标标准曲线法计算脂水两相中盐酸美金刚胺的浓度,以两相浓度比为盐酸美金刚胺的脂水分配系数。1.2.3脂相进样测定按“1.2.2”项下方法配制PMH溶液,取水相溶液20μl直接进样测定;取脂相溶液1ml,用甲醇稀释至50ml,取10μl,于60℃水浴中挥干,用100μl流动相溶解,取20μl直接进样测定;采用外标标准曲线法计算PMH脂水两相中的浓度,以两相浓度比为PMH的脂水分配系数。1.2.4刚胺长期进样回归方程分别用相互饱和的脂相和水相配制一系列浓度的MH溶液。按“1.2.2”项下方法测定,以MH与内标的峰面积比对浓度进行线性回归。两相中盐酸美金刚胺0.01～6.37mg·ml-1与峰面积的线性关系良好,得回归方程分别为:Y水相=0.869X+0.029(r=0.9995)和Y脂相=0.964X+0.089(r=0.9996)。PMH按上述操作直接进样,以PMH的峰面积对浓度进行线性回归。PMH水相溶液0.39～50.50μg·ml-1与峰面积的线性关系良好(r=0.9996),回归方程为:Y=1.551×103X+4.755×103。1.2.5mh及pmh的脂水分配系数按“1.2.1”项下方法,测定脂水两相的体积比分别为5:1、3:1、1:1、1:3、1:5时MH及PMH的脂水分配系数。经考察,两种药物在脂水两相的体积比为1:1时均测得最大脂水分配系数。因此,确定测定脂水分配系数的两相体积比为1:1。1.2.6mh和pmh的脂水分配系数测定取两相体积比为1:1,按“1.2.2”项下方法试验,分别测定经恒温振荡1、3、5、12、16、24h后MH与PMH的脂水分配系数。经考察,药物两相平衡所需时间均为16h。取两相体积比为1:1,按“1.2.2”项下方法试验,分别在25℃、37℃下恒温振荡达平衡后测定MH与PMH的脂水分配系数。经考察,振荡温度对其脂水分配系数的影响较小。1.2.7脂水分配系数分别精密称取MH与PMH适量,照“1.2.2”项下方法测定其脂水分配系数并进行比较。结果,PMH的脂水分配系数为277.05,MH的脂水分配系数为2.09。试验表明,PMH的脂水分配系数明显大于MH的脂水分配系数,显示前者具有较高的脂溶性。2脂水两相溶剂的选择由此盐酸美金刚胺(MH)无紫外吸收,采用常规HPLC-UV法无法检测,因此,须建立柱前衍生化法。PMH有较强的紫外吸收,可用HPLC-UV法直接测定。以衍生化试剂苯甲酰氯,与MH发生亲核取代反应转化为芳香衍生物,可增大其紫外吸收和脂溶性,从而可用UV法检测。试验表明,所建方法专属性强,准确度及精密度较高,可用于测定MH及其PMH脂水分配系数的测定。选择合适的脂水两相溶剂对于准确测定MH、PMH的脂水分配系数十分重要。二氯甲烷和三氯甲烷均为脂相溶剂。以二氯甲烷为脂相时,MH在水中几乎无分布,即脂水分配系数极大;以三氯甲烷为脂相时,MH在水相中有一定分布,故确定以三氯甲烷为脂相溶剂。进行水相溶剂选择时,考虑到MH、PMH均为有机弱碱盐,为增大其脂溶性,选用呈弱碱性的磷酸盐缓冲液(pH7.8～8.0)作为水相。考察中发现,在相对较低温度下,MH和PMH的脂水分配系数略有增加,这种情况与通常情况下物质溶解度随温度降低而减小有所不同。可能是由于温度对两相溶解