大鼠腰5脊神经和脊神经根不同部位损伤对神经病理性疼痛的影响

大鼠腰5脊神经和脊神经根不同部位损伤对神经病理性疼痛的影响

周围神经损伤和炎症常导致神经激素疼痛，包括疼痛过度过敏（非损伤刺激导致的疼痛）、疼痛反应僵硬和自发疼痛。长期以来国内外学者虽然已经进行了大量研究,但对其产生机制仍然不十分清楚。因此,目前对神经病理性疼痛的治疗也还没有十分有效的措施。临床上交通事故引起的坐骨神经损伤,常引起顽固性疼痛,其损伤的神经包括感觉和运动纤维。椎间盘突出压迫脊神经根,引起慢性腰腿痛,其受累的纤维可能有背根的感觉纤维和前根运动纤维。长期以来,研究者们一直认为病理性疼痛的产生主要是由于外伤和局部炎症导致感受器和感觉传入系统的功能异常而引起,但最近的研究发现选择性损伤坐骨神经中的运动纤维也能引起实验大鼠长达5周以上的后肢痛觉过敏。而脊神经背根损伤对病理性疼痛产生的影响也存在有一些相矛盾的实验结果。因此,本实验通过分别结扎切断大鼠L5脊神经(lumbar5spinalnerveligation,L5SNL)、L5背根(lumbar5dorsalrhizotomy,L5DR)和L5前根(lumbar5ventralrhizotomy,L5VR),结合痛行为学测试,系统观察感觉纤维不同部位的损伤以及选择性损伤运动纤维对大鼠痛觉过敏的诱导作用。实验结果对进一步认识神经病理性疼痛产生的机制和椎间盘脱出引起慢性腰腿痛的原因提供有价值的实验证据。材料和方法1.动物的饲养与实验采用成年雄性SD大鼠,体重180～250g,均由医学院实验动物中心供应。动物分笼饲养,室温保持在23±2℃和50～60%的湿度,12～12h白天-黑夜循环照明。所有实验步骤都尽量减轻动物的痛苦并按照有关实验动物的使用原则操作。实验分为L5SNL加切断、L5DR和L5VR组。每组又包括手术组和假手术组。2.脊神经的切除用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50mg/kg,i.p.)动物。按照Kim等报道的方法对大鼠进行L5SNL并切断。大鼠L5VR按照Li等描述的方法进行。首先在4～6腰椎上方做正中切口,在4至5腰椎间行半椎板切除术,暴露左半部脊髓后,用一锋利细针轻轻划破外侧蛛网膜,直视下看到位于背根下方、外侧的脊神经前根后,用一特制的玻璃分针轻轻从背根下方提起前根,用眼科剪剪去2～3mm,然后用37℃生理盐水冲洗切口,分层缝合肌肉和皮肤,待动物苏醒后放回动物房。大鼠L5DR切除时,打开蛛网膜后,用玻璃分针分离背根并切除2～3mm,其余操作同L5VR。假手术大鼠,除了不切除脊神经前根和背根外,其余手术步骤完全等同于手术组。严格按照无菌操作原则进行手术。所有实验结束后,L5VR和L5DR大鼠都经过解剖以确认前根或背根被切除,而且在L5的位置,不符合标准的动物从实验中去除。3.机械刺激敏感化指标为了消除大鼠心理因素对测试结果的影响,于测试前一周把大鼠放于测试箱内15～20min,隔天一次,共3次。然后按Chaplan等报道的“up-down”法,选用8根呈对数递增的vonFreyhair(0.41、0.70,1.20,2.04,3.63,5.50,8.51,15.14g)检测大鼠机械刺激撤足阈值(pawwithdrawalthreshold,PWT),作为机械刺激敏感化的指标。按照Hargreaves等报道的方法,使用热平板测试仪(PlantarTest7370,UgoBasile,Italy)检测大鼠热刺激撤足潜伏期(pawwithdrawallatency,PWL),作为大鼠热刺激痛觉过敏的指标。PWT和PWL的测试均在每天上午9:00点开始,每2天测试一次,2周后测试间隔逐渐延长。4.ilco麻黄司4.3方法所有行为学测试结果均用非参数检验进行分析。同一组大鼠不同测试时间点的数据用配对的秩和检验(Wilcoxonmatchedpairstest)分析。两个不同实验组某个测试日间的数据比较采用U检验(Mann-WhitneyUtest)。统计学分析通过SPSS10.0(SPSSInc,USA)进行,所有数据用均数±标准误表示,P<0.05认为差异有显著性。结果1.假手术组大鼠机械刺激撤足阈值和热刺激撤足刑期比较L5SNL后大鼠后脚掌皮肤表现出对机械刺激和热刺激痛觉过敏。与手术前基础值和假手术组比较,大鼠50%的机械刺激撤足阈值(图1A)和热刺激撤足潜伏期(图1B)于术后1d显著下降(P<0.05),术后3～7d降至最低(P<0.001),在同侧后肢显著性差异保持到了术后的35d,而在对侧后肢也持续3周以上。2.两组撤足阈值和热刺激撤足刑期比较痛行为学测试发现,L5VR大鼠同侧及对侧后肢50%机械刺激撤足阈值(图2A)和热刺激撤足潜伏期(图2B)与手术前基础值和假手术组比较,手术后1d显著下降(P<0.05),7d降至最低点(P<0.001),显著性差异一直保持至术后5周左右。3.r大鼠50%机械刺激撤足阈值与热刺激撤足刑期比较与手术前基础值和假手术组比较,L5DR大鼠50%机械刺激撤足阈值(图3A)和热刺激撤足潜伏期(图3B)均无明显变化(P>0.05)。结果见图3。运动神经损伤的作用机制本实验发现L5SNL可诱导大鼠产生病理性疼痛,选择性切除L5前根而不损伤初级感觉神经元也能引起大鼠双侧后肢痛觉过敏,但是选择性损伤L5背根却不能引起大鼠的痛行为。表明脊神经和脊神经根不同部位的损伤对病理性疼痛的产生发挥不同的作用。早在1992年Kim等发现大鼠L5SNL可引起双侧后肢不同程度的痛觉过敏,损伤同侧后肢的痛行为学变化大持续时间长,对侧后肢的痛觉过敏较轻且持续时间短。本实验发现L5SNL可在术后1d引起双侧后肢明显的痛觉过敏,同侧后肢的痛行为学的变化持续到了术后5周左右,而对侧也维持到了术后3周,结果与Kim等的报道基本一致。L5脊神经是组成坐骨神经的重要分支,其感觉纤维支配大鼠脚掌外侧的皮肤浅感觉。大鼠L5SNL后虽然引起其支配的肌肉运动和皮肤感觉功能障碍,但由于L4脊神经在后肢屈肌反射起主要作用,所以对大鼠屈腿并无显著影响。又由于L3、4、5、6对大鼠脚掌皮肤的支配存在有一定程度的重叠,而且损伤纤维的Wallerian变性会引起临近未损伤的L4、6DRG神经元的敏感化。关于L5SNL引起大鼠病理性疼痛的机制已经有大量的研究。早期的工作主要集中在受损伤的初级感觉神经元形态与功能的变化。但近年来的研究发现邻近未损伤的初级传入神经元可能在L5SNL引起病理性疼痛中发挥更为重要的作用。因为,无论于术前1d,还是于术后7d切除L5背根,都不能阻断和减轻L5SNL引起的大鼠痛觉过敏。但是,如果于术后第7d切除大鼠L4背根,却能使L5SNL引起的痛觉过敏立刻得到缓解。最新的研究证明大鼠L5SNL不仅在L5背根神经节(dorsalrootganglia,DRG),而且在L4DRG也引起了蛋白激酶的激活、离子通道的表达变化和DRG神经元的自发放电。因此,大鼠L5SNL是一个理想而常用的研究病理性疼痛的模型。运动神经纤维损伤在周围神经外伤引起病理性疼痛中的作用一直是一个悬念,而且长期以来没有得到足够的重视。2002年Li等报道选择性切除大鼠前根,而保持感觉神经元的完整,也能诱导大鼠双侧后肢产生长达5周以上的痛觉过敏,结果与本实验一致。L5脊神经前根主要由运动纤维组成,感觉纤维少于4%。关于运动纤维损伤引起大鼠病理性疼痛的机制,目前大都认为是由于损伤纤维局部致炎因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)和神经生长因子的释放引起炎症细胞浸润,并进而引起损伤纤维的Wallerian变性,在局部引起慢性炎症。在此过程释放的大量细胞因子作用于邻近未损伤的初级感觉神经元,导致其功能改变而引起痛觉过敏。Wu等发现大鼠L5VR后,L4DRG呈现自发放电形式,并伴有痛行为学改变。作者本人最近的研究发现预先使用TNF-α合成抑制剂可阻断L5VR引起的大鼠病理性疼痛。提示运动纤维损伤刺激释放的细胞因子可能在其诱导产生的病理性疼痛过程发挥重要作用。关于一侧神经损伤引起对侧后肢痛觉过敏的现象,有人把其称为“镜像痛”(mirrorimagepain),其机制较为复杂。有实验发现鞘内注射胶质细胞抑制剂可阻断对侧后肢的痛行为。提示脊髓胶质细胞的激活和信息传递可能参与介导了“镜像痛”。脊神经背根主要由初级感觉神经元的中枢突组成,其主要功能是传导躯体感觉。因此,在临床上选择性切除背根有时被用来缓解身体某部的顽固性疼痛。由于背根中也含有肌肉牵张反射的传入纤维,所以背根切除也常被用来缓解肌肉痉挛,如肌痉挛性斜颈。但是,有报道一些儿童接受过此手术后,常引起相应皮肤部位出现痛觉过敏样症状。同时,动物实验也发现L5DR并不能有效缓解L5SNL引起的大鼠病理性疼痛,相反,大鼠L5DR后却产生了明显的痛觉过敏症状。但最近Obata等报道大鼠L5DR仅引起轻微和短暂的痛行为学变化,而选择性切除L5DRG却能引起大鼠病理性疼痛的产生。Ramer等发现,选择性切除背根不引起大鼠的机械刺激和热刺激痛觉过敏,但引起了实验动物冷刺激的敏感化。本实验发现L5DR没有引起大鼠痛行为学