口腔鳞状细胞癌中sanrna和蛋白表达与病理参数的相关性研究

口腔鳞状细胞癌中sanrna和蛋白表达与病理参数的相关性研究

口腔鳞状细胞癌（osc）是头部最常见的肿瘤之一。每年有超过30万新病例，五年生存率仅为50%。虽然近年来在化疗、放疗方面都有很大的进展,但是OSCC患者的预后仍旧很差,其发生的分子机制仍未完全明确。研究认为肿瘤的发生发展是遗传信息改变和表观遗传信息改变共同作用的结果,且后者更易受到外界环境的影响。DNA甲基化是研究最为广泛的一种表观遗传改变,其中抑癌基因启动子区高甲基化被认为是除基因突变和杂合子缺失之外的第三种抑癌基因失活机制。RUNT相关转录因子3(runt-relatedtranscriptionfactor3,RUNX3),位于人染色体1p36,是转录因子RUNX家族成员之一。最近研究表明RUNX3在一系列癌症中表达下调或缺失,且发挥着抑癌基因的作用;启动子区高甲基化是RUNX3基因失活的主要机制。本课题小组已在前期研究中分析RUNX3在OSCC中的表达,本研究拟检测OSCC中RUNX3基因启动子区甲基化状态,并分析其与基因表达以及临床病例参数之间的关系。1材料和方法1.1oscc治疗30例OSCC组织和癌旁组织来自四川大学华西口腔医院颌面外科2005~2006年手术切除的OSCC患者,30例OSCC患者术前未经过放、化疗;10例正常口腔黏膜组织来自该院口腔颌面外科整形手术丢弃组织。收取标本前征得患者同意。标本采集在手术后立刻进行,一部分放入液氮中保存,另外一部分用10%的中性福尔马林固定。所有标本的病理分级按照白色病损国际合作组织和世界卫生组织关于口腔癌的标准来判定。1.2抗鼠抗体检测逆转录聚合酶链反应:Trizol(Sigma公司,美国),AccessQuickTMRT-PCR系统(Promega公司,日本),TaqDNA聚合酶(Takara公司,日本),RUNX3和内参磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)引物由上海英骏生物技术有限公司合成。免疫组化:10%中性福尔马林(Sigma公司,美国);二甲苯、30%过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、枸橼酸三钠、枸橼酸、生物素化羊抗鼠抗体均为国产分析纯;链霉卵白素-生物素-酶复合物(streptavidin-biotin-peroxidasecomplex,SABC)、3,3-二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)、1%山羊血清、加拿大树胶(武汉博士德生物工程有限公司);苏木素(Sigma公司,美国);RUNX3鼠抗人单克隆抗体R3-6E9为新加坡国立大学肿瘤研究所惠赠。甲基化特异性PCR:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane],简称Tris,乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA),胰RNA酶、蛋白酶K(Sigma公司,美国);十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)、醋酸钠、冰醋酸、乙醇为国产分析纯;酚、氯仿、异戊醇为国产分析纯;对苯二酚、亚硫酸氢钠、醋酸钾、冰醋酸为国产分析纯;QIAEXII(QIAGEN公司,美国)。T-A克隆:pGEM®-TEasyVectorSystems(Promega公司,日本)。1.3两段法rt-pcr1.3.1总rna提取对临床收集的10例口腔正常黏膜组织和30例OSCC组织提取总RNA:将组织剪成碎片,然后在液氮下研磨成粉末。加入Trizol,氯仿抽提,异丙醇沉淀,用无RNA酶的蒸馏水溶解RNA沉淀。紫外分光光度计测量RNA浓度。1.3.2pcr检测ndps将模板RNA1μg、5×第一链缓冲液(1stStrandbuffer)4μL、脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTPmixture)1μL、2μL随机引物Oligo(dt)15、高保真逆转录酶(AMVreversetranscrptase)1μL、RNA酶抑制剂(Rnaseinhibitor)1μL、无RNA酶蒸馏水9μL充分混合,置于PCR仪中37℃恒温60min。1.3.3pcr扩增聚合酶系统的构建RUNX3上游引物为5’-GCTGTTATGCGTATTCCCGTAG-3’,RUNX3下游引物为5’-TGAAGTGGCTTGTGGTGCTGAGTGA-3’,退火温度均为55℃,产物大小均为681bp;GAPDH上游引物为5’-ACCACAAGTCCATGCCATCAC-3’,RUNX3下游引物为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’,退火温度均为50℃,产物大小为442bp。取合成的cDNA1μL,PCR缓冲液12.5μL,dNTP1μL,上游引物1μL,下游引物1μL,LA-Taq酶0.25μL,无RNA酶蒸馏水8.25μL共25μL,组成反应体系,置于PCR仪中95℃,5min;以下程序循环40次:95℃1min,55℃1min,72℃1min,最后72℃10min。内参对照GAPDH则把退火温度由55℃改为50℃。1.4免疫组染色1.4.1抗人单克隆抗体组织经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋并将石蜡标本切片。石蜡切片脱蜡至水;过氧化氢封闭内源性过氧化物酶;枸橼酸缓冲液淹没切片,高压锅煮沸,5~7min,然后置于冷水下冲洗;磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)冲洗5min,2次;滴加正常山羊血清封闭,37℃恒温15min。滴加按1∶200比例稀释的一抗即RUNX3鼠抗人单克隆抗体R3-6E9,4℃冰箱过夜;PBS冲洗5min,2次;滴加二抗生物素化羊抗鼠抗体,37℃,40min。PBS冲洗5min,2次;滴加链霉卵白素-生物素-酶复合物(streptavidin-biotin-peroxidasecomplex,SABC),37℃,40min;PBS冲洗5min,2次;DAB显色,苏木素复染;梯度酒精脱水,二甲苯透明,加拿大树胶(或中性树胶)封片。所有标本均在同一条件下进行染色。1.4.2细胞显示阳性免疫染色阳性物质均呈棕黄色颗粒,随机取10个高倍视野,按以下标准判定:①表达阴性,未见染色或仅有小部分(小于10%)细胞可见微量或模糊染色;②表达阳性,大于10%的细胞可见细胞核内染色或胞核与胞浆都有染色;所有切片都采用2人双盲法观察。1.5提取各组dna采用酚-氯仿-异戊醇抽提法进行基因组DNA的提取。1.6pcr检测甲基化状态采用甲基化特异性PCR方法。取1μgDNA,加5μL2mol/L的NaOH,蒸馏水定容至50μL,37℃恒温10min;上述溶液中加入30μL10mmol/L的对苯二酚,3mol/LpH值为5.0的NaHSO3520μL,50℃水浴16h;最后用QIAEXII纯化回收上述处理液中的DNA。亚硫酸处理后非甲基化胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U),而甲基化胞嘧啶(C)不变,针对这种处理后的序列差异设计不同的引物,通过PCR扩增来检测甲基化状态。甲基化DNA扩增上游引物为5’-TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG-3’,下游引物为5’-AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC-3’,退火温度均为65℃,产物大小均为221bp;非甲基化DNA扩增上游引物为5’-TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG-3’,下游引物为5’-AAAACAACCAACACAAACACCTCC-3’,退火温度均为55℃,产物大小均为221bp;以胃癌细胞株MKN47为阳性对照,正常人外周血淋巴细胞为阴性对照,H2O为空白对照。反应结束后取5μLPCR产物,用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,用凝胶扫描及图像分析系统取得图像。1.7橡胶回收用刀片将目的条带切下,用QIAEXII试剂盒行胶回收。1.8细胞培养细胞lura-bertini重组采用pGEM®-TEasy试剂盒(Promega公司,日本)。取2×连接缓冲液5μL,pGEM-T载体1μL,PCR产物1μL,T4DNA连接酶1μL,蒸馏水定容至10μL。将上述溶液混匀,静置1h;离心,收集沉淀,取2μL至消毒的EP管,冰浴;取感受态细胞至冰上溶解,吸取50μL感受态细胞至前述的EP管,轻弹EP管混匀,冰浴20min;42℃热休克45~50s,快速转移至冰上,冰浴2min。加入Luria-Bertani培养基(LB)950mL,37℃摇床孵育1.5h;离心收集细胞(1000g,10min),200μLLB重悬,100μL铺板,平板37℃过夜孵育;蓝白斑筛选,挑白斑,扩增。1.9dna测试序列由上海英骏生物技术有限公司测序。1.10数据统计分析本实验获得数据为计量资料,采用SPSS11.5统计软件对数据进行分析,统计学方法为Mann-Whitney非参数U检验和完全随机多样本的秩和检验(Kruskal-WallisTest)分析,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1oscc中mrna和蛋白表达的变化RT-PCR(图1、图2)和免疫组化结果(图3~10)显示OSCC中RUNX3mRNA和蛋白表达较正常组织明显下调或表达缺失。30例OSCC中有22例(73.3%)呈现表达下调或缺失。2.2癌旁组织的甲基化检测通过甲基化特异性PCR对10例正常口腔黏膜、30例OSCC及癌旁组织中RUNX3基因启动子区甲基化状态进行检测,结果见表1。代表性电泳图可见图11、图12。结果显示70%(21/30)的癌组织和53.3%(16/30)的癌旁组织扩增出甲基化DNA,而10例正常组织均未扩增出甲基化DNA。PCR产物测序结果验证了甲基化特异性PCR的有效性(图13),可见非甲基化DNA经处理后CpG上的胞嘧啶(C)变成了胸腺嘧啶(T),而甲基化DNA经处理后CpG的C保持不变。OSCC和癌旁组织RUNX3基因启动子区甲基化发生频率无统计学差异(P=0.184),结果见表2,提示RUNX3启动子区高甲基化可发生于癌的早期阶段。21例检测出甲基化条带的OSCC组织其表达皆为下调或缺失,而9例检测出非甲基化条带的OSCC组织只有1例表达呈现下调,统计学分析结果显示,RUNX3启动子区高甲基化与其表达呈显著负相关(P=0.001)。2.3高甲基化与osc的临床病理参数之间的关系如表1所示,经统计学分析,RUNX3启动子区高甲基化与临床病理参数之间的关系无统计学意义(P>0.05)。3启动子区高甲基化是主要失活机制之一肿瘤的发生、发展包括了多基因、多因素的协同改变,基因的表达除决定于遗传信息学即DNA序列所传递的信息外,还决定于表观遗传信息。表观遗传学是研究非DNA序列变化的、可遗传的表达改变,其包括了DNA甲基化、组蛋白乙酰化、染色质重塑和非编码RNA调控等。DNA甲基化是研究最早最为深入的表观遗传改变。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的催化下,将S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethioninem,SAM)的甲基转移到胞嘧啶的5’位,使之变为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)的化学修饰过程。DNA异常甲基化则常常导致肿瘤的发生,通常为基因组范围甲基化水平的下降和基因启动子区CpG岛的局部高甲基化。目前研究认为启动子区CpG岛高甲基化成为除基因突变、杂合子缺失以外抑癌基因失活的第三种机制。根据Knudson的“二次打击学说”,甲基化与基因突变和杂合子缺失组合,共同作用于抑癌基因,使其两个等位基因完全失活,从而导致肿瘤的发生。RUNX3是RUNT家族中新近受到广泛关注的基因,被认为是一种新的抑癌基因。RUNX3基因位于染色体1p36,目前研究很多肿瘤在1p36这个位点存在染色体异常,包括胃癌、肝细胞癌、胆管癌和胰腺癌等。研究认为RUNX3是转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)信号通路下游的一个重要组分,参与TGF-β信号通路对上皮细胞生长的负调控作用。同时发现RUNX3蛋白通过与Smad2、Smad3、Smad4协同作用来参与目的基因的转录调控。RUNX3基因敲除的小鼠胃黏膜上皮呈现增生,上皮细胞对TGF-β诱导的凋亡作用不敏感,胃癌细胞株的致瘤性与RUNX3的表达水平呈负相关,这些都表明了RUNX3在胃癌中发挥着抑癌基因的作用。此外在乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌中RUNX3表达都呈现下调。研究表明RUNX3表达失活或下调的主要机制是启动子区的高甲基化,而且通过去甲基化处理RUNX3可以重新被激活。本研究结果显示OSCC中RUNX3的表达下调,RUNX3启动子区高甲基化发生频繁,且可以发生在癌的早期阶段;此外DNA异常甲基化与RUNX3表达呈负相关,说明启动子区高甲基化是RUNX3在口腔鳞癌的失活机制之一。口腔癌周组织学检测显示正常的癌旁组织也可检测出相关基因的异常DNA甲基化,说明DNA甲基化