发酵工程制药-种子扩大培养

种子扩大培养的目的种子扩培的过程种子扩培的目的种子质量的控制菌种选育成品灭菌培养基的优化种子培养发酵生产产物分离纯化一、种子扩大培养指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。为什么要进行种子扩大培养？厌氧发酵罐有氧发酵罐量细菌的生长曲线不同接种量对菌丝生长的影响质二、种子扩大培养的目的具体接种量的大小要根据具体的发酵过程采用的菌种确定。发酵时间的长短与接种量的大小有直接关系，因此在种子扩大培养中必须获得纯而壮的种子，而且还要获得活力旺盛的接种量足够的培养物。菌种扩大培养的目的就是要为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。量质接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间保证产品产量种子扩培的目的三、优良种子应具备的条件菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。01生理性状稳定，以便得到稳定的菌体生长过程02菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求03无杂菌污染，以确保整个发酵过程正常进行；04保持稳定的生产能力，使最终产物的产量维持稳定高产。05三、优良种子应具备的条件种子扩大培养的概念。种子扩大培养的目的。优良种子具备的条件。小结种子扩大培养的过程种子扩培的过程种子扩培的目的种子质量的控制菌种选育成品灭菌培养基的优化种子培养发酵生产产物分离纯化一、种子扩大培养流程实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段斜面培养基中活化扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备种子移种至发酵罐若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生长的繁殖期细胞，菌体细胞应均匀，同步率高。以孢子为接种物，应采用易于萌发的孢子。生理活性强二、对接种物的一般要求：应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发菌株。菌株纯度高，性状稳定，不易发生变异。实验室种子制备包括孢子的制备摇瓶液体种子制备三、实验室种子制备如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量孢子直接用于种子罐接种。对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子；这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。如：灰色链霉菌生产链霉素卡那链霉菌生产卡那霉素

谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸1、孢子的制备（1）霉菌孢子的制备细菌菌体培养时间一般为1-2天，产芽孢的细菌培养则需要5-10天细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37˚C。霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，这些营养物质来源丰富、价廉易得，比琼脂培养基产孢子量大。（2）霉菌孢子的制备培养的温度一般为25-28˚C。培养时间一般为4-14天。（3）放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳氮比以氮少一些为好，避免菌丝大量形成，以利于产生大量孢子。培养的温度一般为28˚C。培养时间一般为5-14天。2、液体种子制备（1）好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体（短菌丝），作为种子。试管三角瓶摇床

种子罐（2）厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）试管三角瓶

卡式罐

种子罐3、培养基选择的原则在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。实验室种子制备的要点种子扩大培养的工艺流程实验室种子制备培养基的选用原则小结种子扩大培养的过程一、生产车间种子制备实验室制备的孢子或摇瓶种子移种到种子罐的过程1、培养基选择的原则培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:

一是成本二是驯化例：柠檬酸发酵

以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%琼脂2%2、种子罐级数的确定一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐级数取决于：菌种生长特性（如菌种传代后的稳定性）、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积发酵罐中种子培养液的最低接种量（种子液体积/培养液体积）以及种子罐与发酵罐的容积比。对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少。如：谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃培养7～10h，菌体浓度达108～109个/ml，即可接入发酵罐作为种子。这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于27℃培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃培养10～24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵）在小型罐（5～500L）中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为一级发酵。比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子酵母生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。细菌总结茄子瓶发酵罐种子罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵放线菌：生长更慢，采用四级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐种子级数确定需注意问题种子罐的级数少，有利于简化工艺和控制，减少染菌几率。级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。01种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。

02种子罐级数除了受产物的品种及生产规模影响，也与选用工艺条件有关。如，改变种子罐的培养条件，加速孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。03孢子悬浮液采用微孔接种法摇瓶菌丝体采用火焰保护接种或者压差法种子罐之间采用压差法接种二、种子罐接种在种子罐接种口周围设有沟槽，沟槽内注入少量酒精，点燃酒精使接种口被围在一圈火焰之中；在火焰圈中即可将菌悬液倒入种子罐中。火焰封口法接种针（含菌悬液或孢子悬液）插入，压力由0.5－0.6kg/cm2降至0.2kg/cm2

，当针插入橡皮塞后，茄子瓶与发酵罐压力平衡，降低罐压，使悬液注入。特点：操作方便，不易染菌，但不宜于菌丝体种子的接种。压差法接种生产车间种子培养基制培养基的选用原则种子罐级数的确定常见的种子罐接种方法小结种子质量的控制措施及案例种子质量优劣的最终检验标准是其在发酵过程中的生产能力。首先必须保证生产菌种的稳定性其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子1、种子质量标准一、种子质量的控制和检测方法1、菌种稳定性的检查单菌分离，摇瓶测定生产能力以不低于其原有的生产活力为原则2、杂菌检查

镜检肉汤或琼脂斜面培养进行检查生化分析

如测定营养消耗的速度、pH变化、溶氧利用情况等3、菌体浓度及形态菌体形态、菌体浓度单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀、排列整齐；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。4、pH和培养基营养成分的变化1）pH2）培养液磷、糖、氨基氮的含量5、产物生成量根据不同培养要求，通过检测种子液中产物生成量，判断种子质量种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。6、酶活力检测7、种子液的外观与气味种子液的外观如颜色、粘度、气味可反映种子质量的优劣。二、种子扩大培养的实例砂土管斜面孢子大米孢子一级种子青霉素生产的种子制备工艺流程二级种子发酵培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：用量少而精，有利于孢子生长培养条件：25℃、7天,湿度50%左右1、斜面孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松增加比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：25℃、7天2、大米孢子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆接种量：200亿孢子/吨培养条件：27℃，40小时3、一级种子培养基：同上接种量：10%培养条件：27℃、10-14小时4、二级种子目的：菌体生长青霉素发酵种子的质量要求：菌丝长稠呈丝状、菌丝团较少，有中小空孢，处于Ⅲ—Ⅳ期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，Ⅰ-Ⅳ为年青期，Ⅳ-Ⅵ期合成青霉素的能力最强种子质量优劣的判断指标。种子质量的标准。青霉素工业生产种子培养的工艺。小结种子质量的影响因素一、影响孢子质量的因素及控制培养基培养条件培养时间和冷藏时间1.培养基（1）原材料质量生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。如：四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有一定影响。制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。

原材料质量的波动，起主要作用的是其中的无机离子含量不同如：微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量（2）水质的影响地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。（3）菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。解决方法01030204培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；严格控制灭菌后培养基的质量；供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。2.培养条件（1）温度温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。温度过低，菌种生长发育缓慢；温度过高会使菌丝过早自溶如：土霉素生产种子，在高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等问题2.培养条件（2）湿度制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大影响。湿度低，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢

不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的影响相对湿度斜面外观活孢子数（×108/支）16.5～19上部稀薄，下部稠，略黄

1.225～36上部薄，中部均匀，发白

2.340～45一片白，孢子丰富，稍皱

5.72.培养条件（3）通气量通常需保证足够的通气量。

足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量；搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液产生大量泡沫，增加染菌机会，增加能耗；丝状微生物不宜剧烈搅拌

如：在通气充足下，制备青霉素生产孢子，可使发酵单位提高一倍。土霉素生产菌，一级种子通气量小有利于发酵生产（1）培养时间一般来说，年轻的孢子优于衰老的孢子，过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。3.培养时间和冷藏时间（2）冷藏时间3.培养时间和冷藏时间冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如：土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右，于4℃保存，发现冷藏7-8天菌体细胞开始自溶；而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。例如：在链霉素生产中，斜面孢子在6˚C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。二、影响种子质量的因素及控制孢子的质量培养基培养条件种龄接种量1.培养基营养成分适合种子培养的需要选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高营养成分要尽可能与发酵培养基相近。2.培养条件（1）温度适宜的温度有利于种子生长。（2）通气量有足够的通气量可以提高种子质量。（3）pH