一测多评法测定黄芪中4种异黄酮类成分

一测多评法测定黄芪中4种异黄酮类成分

黄鼠狼（astagaliradix）的名字来自蒙古的astagalemembregi（b）；var.meb.a.h垂直属c或膜宁夏a.meblaceus（b）。干燥的根，其中蒙古黄鼠狼是其主要品种。黄芪的主要活性成分为黄酮类、皂苷类和多糖类化合物。研究表明,黄芪中的黄酮类化合物具有调节免疫、抗病毒、清除自由基等多方面的药理作用,其中含量较高的主要为异黄酮苷类成分(毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷)及其相应的苷元(毛蕊异黄酮、芒柄花素)。中药的多成分、多功效的作用特点,决定着单一成分难以表达中药的质量,因此,多成分多指标含量测定是当前国际上广泛认可的质量评价模式。迄今为止,已有通过同步测定以上4种异黄酮类成分对黄芪进行质量控制的报道。但毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷等对照品的供应不足严重限制了多成分含量测定法在实际生产和市场监督中的应用。对此,本文应用“一测多评”法(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysinglemarker,QAMS)实现黄芪多指标质量控制,即应用其中1个对照品易获得的成分(芒柄花素),通过建立该成分与其余待测成分(毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮)间的相对校正因子,计算出其余成分的含量,实现多指标质量控制。1高效液相色谱法测定电子在ag采用phenose-cs/ms-3-b211d电子文件1.Agilent1100高效液相色谱仪(G1312ABinPump,G1322ADegasser,G1367AWPALS,G1315BDAD),Agilent1200高效液相色谱仪(G1311AQuatPump,G1322ADegasser,G1329AALS,G1314BVWD),ChemStation色谱工作站,AgilentExtend-C18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexGemini-C18(4.6mm×250mm,5μm),HederaODS-2(4.6mm×250mm,5μm),ShimpackCLC-ODS(6.0mm×150mm)。BP211D电子分析天平(Sartorius)。AgilentLC-Q-TOFMS系统(Agilent1200高效液相色谱仪,ESI离子源,AgilentLC-MS-Q-TOFVer.A.01.00,AgilentMassHunterWorkstationSoftwareQualitativeAnalysisB.02.00)。毛蕊异黄酮苷(calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside,CG)、芒柄花苷(ononin,ON)、毛蕊异黄酮(calycosin,CL)、芒柄花素(formononetin,FO)4种对照品均由实验室自制,结构经1H-NMR,13C-NMR,以及MS确证,HPLC(峰面积归一化法)纯度均>98%。乙腈为色谱纯,水为Milli-Q超纯水,其他试剂均为分析纯。黄芪药材及饮片购自全国各地,经本校李萍教授鉴定为蒙古黄芪A.membranaceusvar.mongholicus或膜荚黄芪A.membranaceus的干燥根。2方法和结果2.1毛用明酮含量测定在一定范围(线性范围)内成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比,即W=fA,可得响应因子f=WA①f=WA①。在黄芪多指标质量评价时,以药材中芒柄花素为内标,建立其与毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮之间的校正因子,通过校正因子计算毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮的含量。校正因子fk/m定义如下:fk/m=fkfm=Wk×AmWm×Akfk/m=fkfm=Wk×AmWm×Ak②由此可导出定量计算公式:Wm=Wk×Amfk/m×AkWm=Wk×Amfk/m×Ak③式中Ak为内标物峰面积,Wk为内标物的质量。Am为其他组分m的峰面积;Wm为其他组分m的质量。在实际测定时,用外标法测定芒柄花素的含量,再通过校正因子计算毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮的含量,同时用常规外标法进行同步测定,以验证计算值的正确性和可行性。2.2方法研究2.2.1abb3%苯甲酸水溶液anb的溶液洗脱程序℃;流速1.0mL·min-1;检测波长248nm,258nm;流动相:0.3%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱程序0~12min,20~37B%;12~16min,37~40B%;16~22min,40~50B%;22~28min,50~100B%。上述色谱条件下,各组分分离度良好,见图1。2.2.2l量瓶内固相瓶中l量瓶的检测分别精密称定毛蕊异黄酮苷2.42mg,芒柄花苷1.53mg,各置于5mL量瓶中;毛蕊异黄酮2.61mg,芒柄花素1.56mg,各置于10mL量瓶中,用甲醇溶解稀释至刻度,制得各单一对照品溶液,分别量取不同体积单一对照品溶液,混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液,保存于4℃冰箱,备用。2.2.3制备多孔多孔多孔耐氧体膜取黄芪干燥粉末约1g(过60目筛),精密称定,置圆底烧瓶中,加甲醇50mL,加热回流4h,放冷,滤过,滤液回收甲醇至小体积,转移至5mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,过0.22μm微孔滤膜,弃去初滤液,取续滤液备用。2.2.4标准曲线的建立将2.2.2项下制得的混合对照品溶液,每个浓度进样3次,各进样10μL,以进样量(X,μg)为横坐标,平均峰面积(Y)为纵坐标作标准曲线,并以最小二乘法计算回归方程,见表1。2.2.5条件三:药剂免疫因子根据2.1项中公式①,②,结合2.2.4项所用系列浓度对照品溶液所得峰面积数据,计算毛蕊异黄酮苷(CG)、芒柄花苷(ON)、毛蕊异黄酮(CL)与芒柄花素(FO)之间的校正因子如下:fFO/CG=fFOfCG=0.4801‚fFO/ON=fFOfON=0.5578‚fFO/CL=fFOfCL=0.8565fFΟ/CG=fFΟfCG=0.4801‚fFΟ/ΟΝ=fFΟfΟΝ=0.5578‚fFΟ/CL=fFΟfCL=0.8565。2.2.6互相配合的药剂取线性关系项下高、中、低3个浓度的对照品溶液,于1d内每个浓度连续进3针,所得峰面积的RSD为日内精密度,毛蕊异黄酮苷峰面积RSD分别为0.10%,1.10%,0.90%;芒柄花苷分别为0.60%,1.20%,0.60%;毛蕊异黄酮分别为1.00%,0.40%,0.70%;芒柄花素分别为0.10%,1.10%,0.90%。取1个浓度的对照品溶液,连续3d,每天进3针,所得峰面积的RSD为日间精密度,毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积的RSD分别为2.2%,0.60%,1.1%,0.60%,表明仪器的精密度良好。2.2.7重复性的测定称取黄芪(HQ13)干燥粉末(过60目筛)约1g,共6份,精密称定,按2.2.3项下制备样品,测定6份样品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的平均质量分数分别为0.0187%,0.0087%,0.0231%,0.0160%,RSD分别为2.8%,2.8%,2.9%,2.6%(n=6),表明该方法的重复性良好。2.2.8溶液稳定性试验取同一供试品溶液(HQ13),分别放置0,2,4,6,8,12,24,48h后进样分析,每次进样10μL,记录峰面积,毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积的RSD分别为2.8%,1.5%,0.6%,0.5%,表明供试品溶液在48h内稳定。2.2.9加样回收率试验精密称取适量含量已知的黄芪药材(HQ13)粉末(过60目筛)9份,每份约0.5g,精密称定,随机分为3组,每组按照药材含量80%,100%,120%的比例分别加入毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品,加入甲醇补足至50mL,按2.2.3项下制备样品,测定,计算加样回收率,毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的加样回收率分别为99.8%,100.7%,100.3%,101.6%,RSD分别为2.7%,2.2%,3.0%,2.8%。2.3修正因素的系统适应性研究2.3.1高效液相色谱测定取2.2.2项下系列混合对照品溶液,进样10μL测定,按2.2.5项下分别计算毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮与芒柄花素间的校正因子。使用同一高效液相色谱仪(Agilent1100)考察了4根不同型号色谱柱AgilentExtendC18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexGemini-C18(4.6mm×250mm,5μm),HederaODS-2(4.6mm×250mm,5μm),ShimpackCLC-ODS(6.0mm×150mm)测定的校正因子。并进一步考察了Agilent1100,Agilent1200和ShimadzuLC-10AT3台不同高效液相色谱系统,其中Agilent1100检测器为DAD,检测波长为248nm,258nm;Agilent1200检测器为可变波长检测器VWD,使用程序波长:0~11min,258nm,11~28min,248nm;ShimadzuLC-10AT为单波长紫外检测器,检测波长为248nm,258nm,见表2。2.3.2色谱峰的确定“一测多评”法在实际应用中,利用相对校正因子计算含量,无需用到部分待测组分的对照品,但势必会遇到如何对这些组分的色谱峰进行定位的问题。中药成分复杂,色谱图中除待测组分色谱峰外,还存在多个其他色谱峰,因此对待测组分色谱峰的正确定位是准确测定的前提。考察了待测组分与内参物保留时间差值的变化情况见表3。4种成分在不同色谱柱和色谱仪上保留时间有所差别,但芒柄花素相对于其他3种成分的保留时间差值变化不大。为此,选择采用待测组分与内参物保留时间的差值定位。实验所得芒柄花素与毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮的保留时间差分别为15.853,10.756,7.800,可供参考。采用液质联用技术对上述色谱峰定位进行了验证。对待测组分色谱峰的质谱分析结果见图2,表明色谱峰定位正确;进一步比较4个对照品与样品中对应峰的质谱图,结果二者一致,由此可判断药材中这4个成分的色谱峰和其他成分完全分开,无杂质干扰,可进行准确定量。在本“一测多评”法的实际应用中,可参考药材典型色谱图,并计算待测组分与内参物的保留时间差值,同时结合化合物的紫外吸收特征,基本能够正确判断出目标峰的位置。2.4两个样本含量比较按2.2.3制备22批黄芪药材(编号HQ01~HQ22)和12批黄芪饮片(编号HQP01~HQP12),分别进样10μL,平行测定3次,采用外标法和QAMS法分别计算毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量。分别用夹角余弦值、Pearson系数与相关系数对两法所得含量进行比较,结果表明两法所得含量相似性极高;另其含量间的相对标准偏差亦在3.5%以内,表明2种含量测定方法无显著性差异,QAMS在黄芪的多指标成分质量评价中应用是可行的,见表4。3讨论3.1保留时间差值波动芒柄花素对照品市场上可购得,且实验发现,以芒柄花素为内参物,在不同色谱柱和不同仪器上保留时间差值波动最小,均在5%以内,而若以毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷或毛蕊异黄酮为内参物,保留时间差值的波动均大于5%,不宜进行待测组分色谱峰的定位。故最终确定以芒柄花素为内参物,建立了黄芪中4个异黄酮类成分的“一测多评”方法。3.2高效液相色谱法为考察不同仪器和色谱柱对校正因子的影响,本实验分别考察了Agilent1100、Agilent1200及ShimadzuLC-10AT3台高效液相色谱仪,和4根不同品牌的色谱柱。发现芒柄花苷、毛蕊异黄酮校正因子较稳定,而毛蕊异黄酮苷在不同色谱仪上所得校正因子偏差较大,可能与该化合物的响应有关。3.3相似度评价方法对比本实验用外标法所得含量实测值与QAMS法所得计算值进行比较,评价QAMS的准确性和科学性。目前用于相似度评价方法主要有夹角余弦值法、相关系数法、Pearson系数等,各种相似度评价方法有各自的特点和不足。本实验分别计算夹角余弦值、相关系数和Pearson系数,比较实测值和计算值的贴近程度。3种方法均显示两组数据有极高的相似性,且夹角余弦值对数据波动较灵敏。同时两组数据的相对标准偏差均在3.5%以内,表明两种含量测定方法之间无显著性差异。3.4提取方式的确定考察了纯甲醇、80%甲醇、50%甲醇和纯乙醇等溶剂对黄芪中4种异黄酮类成分提取效率的影响,结果发现纯甲醇对4种异黄酮类成分的提取效率均较高,且提出杂质较少。进一步以纯甲醇为提取溶剂,比较超声和回流2种提取方式对4种异黄酮类成分提取效率的影响,结果发现回流明显高于超声提取,且超声提取的稳定性