还原型谷胱甘肽的分离纯化及回收利用

还原型谷胱甘肽的分离纯化及回收利用

谷胱甘醇化学特征：n-（n-l--glyzer-l-cystonin）glycine，即n-{n-l--谷氨酸半胱氨酸。谷胱甘肽是机体内的重要活性物质,它具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。临床用于中毒性肝炎和感染性肝炎治疗,有机物及重金属的解毒,癌症辐射和化疗的保护,抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的改善,对肺纤维化、肝癌、卵巢癌、艾滋病也是有益的联合用药,亦广泛用于食品加工业、化妆品工业等。本研究是以壳聚糖为吸附剂通过吸附层析法,从啤酒废酵母的预处理以及细胞破碎得到富含谷胱甘肽抽提液,分离纯化还原型谷胱甘肽;试图为填补我国GSH生产空白做点工作。本试验用的壳聚糖是一种无毒、价廉的天然新型吸附剂,用它从啤酒废酵母中提取还原型谷胱甘肽的方法目前未见文献报道。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验材料啤酒废酵母抽提液:由废酵母抽提液制备组提供。壳聚糖:市售,分子量270kD,脱乙酰度:87.22%。1.1.2化学试剂及试剂偏磷酸:分析纯,中国医药(集团)上海化学试剂公司;碘酸钾:分析纯,上海化学试剂采购供应站;环氧氯丙烷:分析纯,天津市博迪化工有限公司。1.1.3精密增力电机加热器层析柱:定制直径16×600mm、直径40×600mm。RE-52A旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;JJ-I型精密增力电动搅拌器,常州国华电器有限公司;BSZ-100自动部分收集器,上海泸西分析仪器厂。1.1.4碘化钾的滴定取5ml的待测样品,置于250ml的锥形瓶中,加入5ml的2%偏磷酸溶液,1ml5%的碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂,用碘酸钾溶液0.001mol/l滴定至溶液由无色变为蓝色即为滴定终点。每毫升待测液中GSH含量=滴定值×0.001×307.22/V,V为吸取的待测液的毫升数。1.2测试方法工艺流程:1.2.1柱结构1.2.1.壳聚糖功能设计取平均分子量为27万的壳聚糖溶于1%的醋酸溶液中制成质量分数为3%的壳聚糖醋酸溶液,用针形注射器把壳聚糖醋酸溶液注入凝结液中,控制针头与液面的距离和液滴落下的速度,得到粒度均匀,形状规则,内有空心的白色壳聚糖小球,水洗至中型,用丙酮洗涤脱水.将壳聚糖小球置于环氧氯丙烷中,环氧氯丙烷的量以浸没壳聚糖小球为准。室温下电磁搅拌4h,用水和丙酮反复洗涤,洗去环氧氯丙烷,得到有一定机械强度,对酸碱有一定耐受性的交联壳聚糖小球,小球置于于稀碱液中备用。1.2.1.壳聚糖小鼠的溶解实验分别配置pH为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的缓冲溶液25ml置于小烧杯中,向其中加入1g除去表面水的形壳聚糖小球,常温下静置24h,观察壳聚糖小球的溶解情况。1.2.2壳聚糖非织造布的装复取60g球形交联壳聚糖(用滤纸吸去表面水),悬浮于水中并搅拌均匀,连同水一起装入Φ16×600mm的层析柱中,保证装柱时均匀、松紧一致且无气泡产生,并用水覆盖壳聚糖小球表面上。1.2.3gsh的吸附及测定分别配置pH值为6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液45ml,向其中加入除去表面水的球形交联壳聚糖(5g),然后加入5ml的啤酒废酵母抽提液,常温下在摇床上以180r/min震荡12h,测定震荡前后的GSH的含量,计算其吸附率与静态吸附量。吸附率E=(ρO-ρe)/ρOρO:酵母抽提液中GSH初始质量浓度;ρe:吸附平衡后溶液中GSH的质量浓度。静态吸附量qe=(ρO-ρe)V/MV:酵母抽提液体积;M:球形交联壳聚糖的质量。1.2.4最佳洗脱ph的确定用pH值为7.0磷酸盐缓冲液平衡层析柱,取5ml啤酒废酵母抽提液,调节其pH值7.0。把酵母抽提液倾入层析柱中,分别用pH为6.5、6.0、5.5、5.0、4.4的缓冲溶液洗脱,部分收集(5ml/管)洗脱液,直到无GSH流出,检测每管洗脱液中GSH的含量,以洗脱液体积(以收集的管数表示)为横坐标,以流出GSH含量占上样GSH含量百分比为纵坐标绘制GSH的随体积流出曲线,并据此确定最佳洗脱pH值。1.2.5gsh洗脱率的测定于直径40×600mm的层析柱中按照1.5.1.3方法装柱。上样50ml,部分收集(50ml/管),测定每管洗脱液中的GSH含量,按照1.5.5方法绘制GSH的随体积流出曲线,根据曲线确定GSH集中流出体积段,做平行试验,集中历次洗脱液。按照1.4方法测定其中GSH含量计算洗脱率并计算得率与纯度。洗脱率=(GSH洗脱液的体积×GSH洗脱液的浓度)/(GSH上柱液的体积×GSH上柱液的浓度)×100%2结果分析2.1壳聚糖功能分析凝结液的配方以及壳聚糖溶液的质量浓度,针形注射器针头的孔径,针头距凝结液液面的距离对载体的成型具有重要影响。针头距液面太高,壳聚糖液滴下落速度较大,其接触液面瞬间,液滴与液面间又有一个较大的冲力使液滴变为片状,不能成为内有空心的壳聚糖小球。针头距液面太近,所产生的冲力不足以使液滴迅速浸入凝结液,小球下部分迅速凝结,而上部分凝结较慢,从而形成的小球并不规则。针头孔径对壳聚糖小球形状也有影响,孔径较大,形成的小球较扁,孔径较小形成的小球较圆。从试验看,直径3mm的针头距液面10cm左右可得到的形状规则,内有空心壳聚糖小球。2.2地壳聚糖球的酸溶解试验结果由上表试验结果说明壳聚糖小球对酸有一定的耐受性,pH值在4.0以上时壳聚糖小球不溶解。2.3u3000gh的ph值由此可见,上柱的啤酒废酵母抽提液在pH值为7.0的条件下,壳聚糖小球对GSH有最大的静态吸附量和吸附率,因此确定pH7.0为啤酒废酵母抽提液的最佳上柱pH值。由于球形交联壳聚糖表面带有大量的正电荷,调节GSH的pH值与等电点5.93以上可以使GSH分子带上负电荷,通过正负电荷间的吸引作用可以使GSH分子牢固的结合在壳聚糖表面上。选择合适的pH值,使壳聚糖与GSH有适中吸附力和最大的静态吸附量。2.4在洗脱液中的提取谷胱甘肽由图1可知,以壳聚糖小球作为吸附剂来吸附分离GSH基本上能够获得单一的流出峰,在洗脱液的pH值为4.4的的情况下,GSH的流出曲线更为集中,收集相关体积段的洗脱液获得的谷胱甘肽浓度较高。2.5洗脱gsh含量图2可知,在扩大试验中,GSH洗脱液对体积流出曲线基本上能够成单一峰。在第350ml到1000ml体积段的洗脱液中GSH的含量相对较高,洗脱率可以达到84.84%。通过平行扩大试验来看,平均洗脱率与洗脱曲线基本相符。图2能够明显说明表3的结果。得到洗脱液1950ml,浓度为1.36mg/100ml,平均洗脱率为84.18%。3还原型谷胱甘肽的洗脱脱率和回收率3.1试验结果表明壳聚糖小球对啤酒废酵母抽提液中GSH有一定的吸附能力.其吸附率为85.68%,最佳提取条件为:上柱GSH抽提液最适pH值为7.0,最适洗脱剂pH值为4.4的磷酸盐缓冲液。在最适吸附条件下,还原型谷胱甘肽的平均洗脱率为84.18%,平均回收率79