应用lamp法进行胚胎性别鉴定及胚胎移植

应用lamp法进行胚胎性别鉴定及胚胎移植

1序言1.1通过推进牛奶性别控制技术实现奶牛性别控制一直是奶牛生产者的愿望。使奶牛多生母犊,可快速增加良种奶牛数量的同时,也提高了牛群的质量,促进我国奶牛业向质量型方向发展,这项技术是目前我国奶牛处于发展增长时期应认真重视的主要技术途径。此外,我国目前90%左右的奶牛集中在农户和集体养殖场饲养,通过奶牛性别控制实现多生母犊,可明显提高其经济效益,有利于促进“三农”问题的解决,而且可以减少从国外进口奶牛的外汇支出。奶牛性别控制技术有明显的经济效益,2003年我国奶牛存栏数超过800万头,按适繁母牛为55%计算,约有440万头。繁殖成活率按80%计算,每年约繁殖352万头后代,母犊与公犊比例为1∶1,每年增加176万头母犊。若采用分离X精子冷冻精液输精,使产母犊率达到90%～95%,每年将出生316.8～364.4万头母犊,比176万头增加了149.2～187.6万头。若采用改变母牛子宫生理生化环境的性控技术方法,试验结果已证明雌性胚胎率达70%～75%,每年将出生246～264万头母犊,比176万头增加70～88万头。以每头母犊4000元计算,每年分别可增加59.68～75.04亿元和28～35亿元。1.2对精子的性别控制技术:主要有2.目前性别控制技术主要有以下两个途径:(1)胚胎性别鉴定技术:通过超排供体母牛采集到的胚胎,切割取样后,采用PCR扩增技术,对胚胎性别进行鉴定,性别鉴定的准确率达到95%～100%。由于试剂盒价格较高,对实验室条件和技术人员熟练程度要求较高,再加上丢弃一半的胚胎等原因,难于在生产现场条件下大面积推广应用。(2)卵子受精前的性别控制技术:目前主要从以下两个方面进行试验研究,a.精子分离法:应用流式细胞分离仪分离的X精子冷冻精液进行人工授精,目前已经取得了产母犊率达到90%～95%的应用试验结果。但0.25ml含200万有效X精子的冷冻精液,销售价格为400～500元,情期受胎率比普通冷冻精液降低10%左右,每妊娠1头母牛仅精液成本就需1000～1300元以上,不易在奶牛人工授精生产中进行广泛推广应用,主要用于生产体外和体内性控胚胎,以及良种高产奶牛群的快速扩群。b.改变母牛子宫生理生化环境法:对发情母牛于输精前,将性控药物注入子宫,使子宫形成有利于X精子,而不利于Y精子的生理生化环境,达到性别控制的效果。目前已经有雌性控制率分别达到55%～69%和70%～75%的不同药物,但还需要从控制效率和重复稳定性方面进行研究和提高,才能广泛应用。现将我们2003年8月～2005年5月开展的不同奶牛性别控制技术方法的试验研究情况总结如下。2材料和方法2.1试验对象和药物2.1.1试验动物2.1.2药物、试剂和相对生物FSH:中国科学院动物研究所;PG:上海计划生育研究所;奶牛性控胶囊:北京三牛兴业科技发展有限责任公司,由4种中草药提取物配制而成;奶牛性控液:自制,由4种化学药物配制而成;分离X精子冷冻精液:加拿大爱德现代牛业发展集团和内蒙赛科星生物技术有限公司生产的X精子冷冻精液;性别鉴定仪和性别鉴定试剂盒:Lamp-100胚胎性别鉴定仪及相应试剂盒,日本荣研株式会社生产。2.2测试方法2.2.1肌注、输精方法(1)超排方法:供体母牛经2次PG同期发情处理,于第2次同期发情后9～13d开始超排。FSH超排总剂量为8.4～8.8mg(根据月龄、体重等确定不同剂量),连续肌注4d,每天早晚各1次,剂量依次递减,超排第3d早晚各肌注PG1次。(2)输精方法:发情后10～12h,输精1次(1支精液,两侧子宫角各半只),间隔8～10h;第2次输精(2支精液,两侧子宫角各1只);第3次输精前先检查卵巢卵泡,若大部分已排卵,则不再输精;若大部分未排,则再一次输精(1支精液,两侧或未排一侧子宫角)。2.2.2输注运行(1)奶牛性控胶囊:每粒胶囊用2ml生理盐水溶解后输入子宫体分叉处,间隔60min后输精。(2)奶牛性控液:超排前7d和超排开始时分别宫注40ml,发情后直接用冷冻精液输精。2.2.3作为样品的样品将洗净的胚胎移入专用切割液中,徒手切取胚胎10%以上的细胞团,作为样品。采用恒温循环基因扩增法,6种引物同时与样品中的雄性特异核酸系列和雌雄共有的核酸系列进行扩增反应,然后通过检测反应过程中生成的副产品焦磷酸镁所形成的白色浑浊物,判断胚胎的性别。3试验结果与分析3.1性别鉴定效果2003年8月～2004年8月,共处理116头供体母牛,采集到668枚可用胚胎。共鉴定613枚胚胎,将298枚雌性胚胎和12枚雄性胚胎进行移植。由表1可见,对从超排供体母牛采集的613枚胚胎进行性别鉴定,得到的鉴定结果为:雌性胚胎302枚(49.3%),雄性胚胎311枚(50.7%)。性别鉴定后雌性胚胎的移植成功率为38.0%～43.8%,平均为40.9%(122/298),由此可见在适宜条件下,胚胎在体外培养4～8h,对移植成功率影响不显著。其中青岛地区由于受体母牛比较分散,移植技术人员早期经验较少,故移植成功率低于40%。共出生移植后代121头,其中母犊117头,准确率为95.9%(117/122),公犊4头,准确率为100%(4/4),总的性别鉴定准确率为96.0%(121/126)。LAMP胚胎性别鉴定技术仅需一台Loopamp终端浊度测定仪,40min即可完成扩增、检测、判定整个过程,而且性别鉴定准确率达到96%以上,但是需要专门的仪器和试剂盒,较高的实验室条件,对技术人员熟练程度要求较高,而且试剂盒价格较高。另外,还要丢弃50%左右的胚胎(雄性胚胎)。胚胎切割后进行冷冻保存,解冻后胚胎的成活率及移植成功率都有一定程度的降低。因此在生产实际中的应用推广面受到一定影响。3.2牛性别控制胶囊的性别控制效果测试3.2.1重复性实验结果由表2可见,二批试验的雌性胚胎率分别达到70.8%(34/48)和75%(12/16),平均为71.9%(46/64),说明其性控效果的重复性较稳定。3.2.2受精率及精密率由表2可见,14头供体母牛采集约116枚胚胎中,可用胚胎69枚,受精率87.5%(105/116)。头均获4.9枚可用胚胎,与以往未采用性控胶囊的供体母牛头均获5～6枚可用胚胎相近,说明应用性控胶囊不影响胚胎的受精率和胚胎的可用率。3.2.3明性控胶囊溶液(1)Ⅰ组4ml生理盐水溶解一粒胶囊,在输精前1h,每侧子宫角注2ml,14枚胚胎(包括1枚发育停滞)的性别鉴定结果雌性胚胎率71.4%(10/14)。Ⅱ组用2毫升生理盐水溶解一粒胶囊,在输精前40min注入子宫体分叉处,19枚胚胎(包括5枚发育停滞胚胎)的性别鉴定结果,雌性胚胎率52.6%(10/19)。说明性控胶囊溶液应有一定的体积,一定的作用时间和作用部位。(2)对供体母牛超排技术方案进行改进,调整FSH总剂量,根据母牛的月龄、体重,区别用量,且肌注的FSH剂量逐日递减,头均可用胚胎数由4.8～5.3枚提高到6.5～7.0枚。说明超排技术方案是影响胚胎数量和质量的主要原因。3.3牛奶性别控制的影响试验3.3.1不同性别控制方法对胚胎性别的影响由表4可见,超排供体母牛在超排前及超排后宫注性控液,可获得雌性胚胎率达到73.9%(17/23)。说明有较好的胚胎性别控制效果,但性控液使用方法不同,效果不同。超排前7d及超排开始时各加一次性控液,雌性胚胎率为83.3%(5/6);而在超排第3d肌注PG时只加一次性控液,雌性胚胎率为70.6%(12/17),说明加两次药比加一次药的性别控制效果好。奶牛性控液是很有苗头的性别控制药物,但由于试验数据较少,还有待于进一步试验。3.3.2发育率和胚胎的可用率供体母牛头均可获得5.3枚可用胚胎,胚胎受精率为73.3%(33/45),发育率为48.5%(16/33),胚胎的可用率为35.6%(16/45),说明对胚胎的数量和质量没有明显影响。3.4u3000x精子的超排效果(1)表5中加拿大爱德公司的性控精液最后一次试验中,处理2头供体母牛,其中一头采集到0枚胚胎,另一头采集到15枚胚胎,受精率80%(12/15),发育率100%(12/12)。由此可见,分离X精子冷冻精液虽然有效精子数较少,解冻活力较低,但并不影响卵子的受精和胚胎的发育。(2)由表5可见,每支0.25ml分离X精子冷冻精液,仅含200万个有效精子,解冻活力为0.2～0.35,但平均受精率为74.8%(86/115),发育率为76.7%(68/86),胚胎的可用率为5.5枚/头,冷冻性控胚胎移植后40d未返情率为63.6%(7/11)。这说明已经达到供体母牛用常规冷冻精液输精的平均超排效果。但超排技术方案是直接影响超排效果的主要因素。如表5中4头供体母牛组的超排效果较差,主要是FSH总剂量过高,而且超排方案的递减剂量安排也不合理,经进行调整后超排效果均明显提高。(3)在从12头供体母牛采集到的胚胎中,抽样61枚胚胎用LAMP胚胎性别鉴定方法进行性别鉴定,得到结果为雌性胚胎率100%(61/61)。因流式精子分离仪分离速率控制在4500～5000个X精子/s,X精子的分离纯度为91%左右,本试验的性别鉴定胚胎数量较少,需进一步试验后才能得出最后的结论。这几次试验结果证明,应用分离X精子冷冻精液进行体内性控胚胎的生产,已经取得良好的超排效果和胚胎性别控制效果,可以大规模推广应用。4提高男性发育的性别比例(1)奶牛胚胎性别鉴定技术,性别鉴定准确率达到96.0%(121/126),由于试剂盒价格较高,对实验室条件以及技术人员熟练程度的要求较高,再加上损失50%左右的雄性胚胎等原因,在生产实际中的推广应用有一定的限制。(2)改变母牛子宫内的生理生化环境,抑制Y精子的活力,增强X精子授精机率的性别控制药物,不会降低超排母牛胚胎的数量和质量,雌性率可达70%～80%。另外,由于操作简便,成本低,比目前人工授精母牛的产母犊率48%提高了22%～32%,可以在生产上