地衣芽孢杆菌产酶特性的初步研究

地衣芽孢杆菌产酶特性的初步研究

自20世纪80年代以来，国外开始应用饲料酶添加剂，以提高生产力，并取得了一些成果。目前,已有愈来愈多的食品动物饲料把饲料酶制剂作为一种常规的有效成分。但由于几乎所有的饲料酶添加剂都存在着不耐高温的致命弱点,各种试验结果差异较大。如何克服这一问题,一直是饲料酶添加剂的生产者和使用者所密切关注的问题。在许多改善酶制剂性能的研究中,用“酶工厂”的形式,将芽孢杆菌添加到动物饲料中,以改善动物的消化功能,开始受到饲料行业的重视。试验以单一碳源培养基对益畜宝的主要活性成分-地衣芽孢杆菌的产酶能力进行初步研究。并在相同的条件下,与大肠杆菌和啤酒酵母菌的产酶能力进行了比较研究。试验通过单一碳源培养基来测试微生物产酶能力。由于试验的设计和所使用的测试材料都还未见报道,所以试验的方法和结果均可为关心饲料酶添加剂发展的人士提供有益的参考资料。材料和方法1试验中的细菌(1)b.丽兹菌从雅来大药厂动物保护部提供的样品中分离得到;(2)e.coli由本所菌种中心提供;(3)啤酒酵母(S.cerevisiae):由本所菌种中心提供。2培养基的制备(1)葡萄糖营养琼脂培养基;(2)淀粉酶试验培养基;(3)脂肪酶试验培养基;(4)植酸酶试验培养基(g/L):植酸3mL,K2HPO40.5g,NH4NO32g,琼脂20～25g,水1000mL,调pH值7.0。(5)纤维素酶试验培养基Ⅰ(g/L):微晶纤维3g,K2HPO40.5g,NH4NO32g,水1000mL,调pH值7.0。(6)纤维素酶试验培养基Ⅱ(g/L):K2HPO40.5g,NH4NO32g,水1000mL,调pH值7.0。将培养基分装试管,每管悬挂一条滤纸条,滤纸条部分浸入培养基中,灭菌,备用。(7)酪蛋白培养基。3生长情况的测定(1)淀粉酶试验方法;(2)脂肪酶试验方法;(3)植酸酶试验方法:将待测菌与对照菌分别划线接种于同一植酸酶试验培养基平板的两边,置于37℃培养24h,观察生长情况。(4)纤维素酶试验方法:将待测菌与对照菌分别接种于纤维素酶试验培养基Ⅱ中,置于37℃培养24h,观察生长情况。(5)蛋白酶试验方法:将浸有待测菌—地衣芽孢杆菌和对照菌的滤纸片分别摆放在酪蛋白培养基平板的两边,用黑色纸紧密包扎于37℃温箱培养32h。观察透明圈直径大小,以此来衡量蛋白酶产生能力的大小。结果与分析1菌苔藓周围透明圈观察将接种了地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母的淀粉酶试验培养基平板,置37℃温箱培养24～32h,取出,在平板上滴加少量碘液,轻轻旋转平皿,使碘液均匀铺满整个平板,观察菌苔周围透明圈情况和大小。结果见图1。从图1可见,地衣芽孢杆菌和大肠杆菌周围产生透明圈,则说明地衣芽孢杆菌和大肠杆菌都产淀粉酶,将淀粉水解而产生透明圈。其中地衣芽孢杆菌菌落直径与出现的透明圈直径之比大肠杆菌的大,说明地衣芽孢杆菌产生淀粉酶的能力比大肠杆菌的强,而啤酒酵母菌周围没有出现透明圈,说明它不产生淀粉酶,不能分解淀粉。2地衣芽孢杆菌、杆菌、啤酒酵母产蛋白酶的情况及其比较将接种了地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母的酪蛋白培养基平板,用黑色纸紧密包扎好于37℃温箱培养32h后,取出,观察地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母产蛋白酶的情况及其比较,结果见图2。从图2可见,地衣芽孢杆菌和大肠杆菌的周围都出现透明圈,则说明产生蛋白酶,且地衣芽孢杆菌菌落直径与产生的透明圈的直径的比值比大肠杆菌的大,则说明地衣芽孢杆菌产蛋白酶的能力比大肠杆菌的强,而啤酒酵母没有生长,可能是在pH值10.0条件下不能生长。3培养基中地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母菌生长情况接种了地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母的植酸酶培养基平板,置37℃温箱培养24h后,取出,观察以植酸为唯一碳源的培养基中的地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母菌的生长情况,结果见图3。从图3可以看出,以植酸为唯一碳源的培养基中,地衣芽孢杆菌生长,即地衣芽孢杆菌可以利用植酸作为碳源而生长,说明它能分泌植酸酶分解植酸;大肠杆菌、啤酒酵母都没有生长,说明它们都不能分解植酸作碳源,因缺乏碳源不能生长,说明它们都不产生植酸酶。4纤维素酶试验(1)培养基中各菌种的活性将接种了地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母的纤维素酶试验培养基Ⅰ平板,37℃温箱培养24h后,取出,观察以微晶纤维为底物的培养基中地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母菌的分解纤维素的情况。由试验结果可知,以微晶纤维为地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母唯一碳源的培养基中,三种菌都没有生长。则说明这三种菌都没有产生纤维素酶的能力,也可能是微晶纤维不能作为它们形成纤维素酶的碳源。(2)酵母地衣芽孢杆菌生长情况将接种了地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母的纤维素酶试验培养基Ⅱ试管,37℃温箱培养24h后,取出观察,地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母都没有生长。结果表明,三者都不能分解滤纸纤维素,即都不产生分解此种纤维素的纤维素酶。5“益养宝”及其助剂对啤酒酵母的活性将接种了地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母的脂肪酶培养基平板,置37℃温箱培养24h,观察平板,判断地衣芽孢杆菌产脂肪酶的情况及其与大肠杆菌、啤酒酵母产脂肪酶的比较,结果见图4。从图4可以看出,地衣芽孢杆菌和大肠杆菌都能生长,但平板底层都没有出现红色斑点,则说明这两种菌都没有分泌脂肪酸分解脂肪的能力,而啤酒酵母没有生长,可能是浮在培养基表面的油脂对啤酒酵母有抑制作用。由以上试验结果可知,“益畜宝”的有效成分—地衣芽孢杆菌能分泌淀粉酶、蛋白酶和植酸酶,不产生脂肪酶和纤维素酶。经与大肠杆菌、啤酒酵母比较试验可知,该地衣芽孢杆菌分泌淀粉酶、蛋白酶活性比大肠杆菌强,而大肠杆菌、啤酒酵母都不产生植酸酶。地衣芽孢杆菌产酶特性植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸。在饲料中添加植酸酶可提高饲料中磷的利用率,降低粪便中磷的排除量,还可降低植酸盐的抗营养作用,因此对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有着重要意义。但植酸酶价格昂贵限制了它的推广应用。试验研究结果表明,雅来“益畜宝”的有效成分—地衣芽孢杆菌能分泌植酸酶,而一般酵母菌和大肠杆菌都不能产生植酸酶。同时该地衣芽孢杆菌又产生淀粉酶和蛋白酶,提高饲料的利用率。地衣芽孢杆菌产酶特性研究初探附图纤维素酶是一个复杂的酶群,鉴于有些微生物不能直接利用天然纤维素生长而只能利用处理过的纤维素,有报道指出,天然纤维素不能作为芽孢杆菌E2菌株形成纤维素酶的碳源,CMC-Na、纤维二糖能作为碳源供芽孢杆菌E2菌株形成纤维素酶。试验仅采用微晶纤维和滤纸为底物进行了试验,受试所有微