抗真菌药物的高通量药物筛选

抗真菌药物的高通量药物筛选

20世纪20年代，这种系统性真菌感染经常出现在那些患有轻度免疫疾病的患者。尸检数据统计表明,死于恶性肿瘤的患者,有一半以上感染了白色念珠菌。现在用于治疗系统性真菌感染的二性霉素B和咪唑类以及用于表皮真菌感染的特比萘酚等药物,存在着活性范围、毒性、不良反应及耐药性等问题。真菌感染的迅速增加及有效药物的缺乏,使新型抗真菌药物的研究和开发显得尤为迫切。基于此,本研究采用两株基因型不同的白色念珠菌菌珠(一株含Ⅰ型内含子核酶,一株不含子核酶和一株非病原真菌啤酒酵母(不含Ⅰ型内含子核酶,为细胞模型,应用高通量筛选的技术平台来筛选高效低毒的潜在抗核酶药物、专一抗白色念珠菌药物以及广谱性抗真菌药物。1材料和方法1.1真菌ca.lsu白色念珠菌4-1,它的26SrRNA上含有能进行自我剪接的Ⅰ型内含子核酶(Ca.LSU);白色念珠菌62-1,它的26SrRNA上不含该核酶,两株白色念珠菌均由加拿大Montrealuniversity的LemayG教授惠赠;啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°,其线粒体上的I型内含子已去除。1.2培养基白色念珠菌4-1和62-1用YPD培养基培养,啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°用YPAD培养基培养,这3种菌株的培养温度都是30℃。1.3dmso主要成分除非特别说明,所有用于高通量筛选的化合物与天然产物均由中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心提供。样品用二甲基亚砜(DMSO)溶解成10mg·mL-1的原始浓度于4℃储存,再用0.95%的氯化钠稀释成100μg·mL-1的终浓度后于-20℃保存。DMSO也相应地被稀释成1%的终浓度。共筛选10720种药物样品,大约有1600种属于天然产物,其余的属于化合物。正对照有两种药物:一种为大蒜油注射液(武汉大学中南医院),属于广谱性抗真菌药物;另一种是核酶抑制剂戊脘脒(pentamidine,美国Sigma公司),对白色念珠菌4-1的生长有一定的特异性。1.4工作站beckman公司Biomek2000实验室自动化工作站(Beckman公司);Fluostargalaxy微板光学测定仪及配套96孔板(BMG公司产品)。1.5生长曲线的测定分别挑取3种菌株的单菌落,于30℃,200r·min-1的摇床上过夜培养13h,测3种菌株的A580nm。在96孔板的第1行12个孔,将3种菌液的起始A580nm,用新鲜液体培养液依次稀释为0.02,0.05,0.1,0.2(不加入任何药物样品,每孔只有100μL稀释后的菌液),30℃恒温培养箱中静止培养2.5h,移至温度设置为30℃的Fluostarggalaxy光学仪中记录A580nm,并静止培养4h,每隔1h记录其A580nm,共5个记录值,用Fluostar软件作出生长曲线图。通过生长曲线的形状来确定筛选条件的最佳起始A580nm。1.6药物样品检测首先进行白色念珠菌4-1的筛选。挑取单菌落于30℃,200r·min-1的摇床上过夜培养13h后,在FluostarGalaxy上测A580nm。于无菌的生理盐水瓶中,用新鲜的YPD培养液将起始菌液浓度的A580nm稀释至0.1A600。筛选时,在每块96孔板中,2-11列共80个孔用来检测药物样品,每孔含10μL药物样品和90μL菌液,药物样品终浓度是10μg·mL-1,DMSO终浓度为0.1%,此浓度的DMSO对真菌的生长几乎没有影响;第1列上面4孔作空白对照,即每孔10μL无菌蒸馏水和90μL菌液;第1列的下面4孔作负对照,每孔10μL无菌蒸馏水和90μL无菌培养液;第12列都作正对照,1∶200和1∶500的大蒜油注射液各2孔,50μmol·L-1和100μmol·L-1的pentamidine各2孔。加样操作都是通过Biomeck2000型实验室自动化工作站的自动化操作系统完成。将96孔板送入30℃的FluostarGalaxy光学仪中第1次测A580nm。测完后于30℃培养箱中无菌静止培养3h,测A580nm。再次培养3h,第3次测A580nm。所有药物样品测试完毕后,再以白色念珠菌62-1进行筛选;最后以啤酒酵母a161I°II°进行筛选,将培养液由YPD替换为YPAD培养液。操作程序同上。1.7s13s1b3-s1b3IC50为抑制真菌生长效率达50%时检测样品的浓度。抑菌效率采取以下公式进行计算:抑菌浓度=1−S3−S1B3−B11-S3-S1B3-B1其中,S1代表每个检测样品在第1次所测的A580nm,S3代表该检测样品在第3次所测的A580nm,相应地,B1代表同一块96孔板的4个空白在第1次所测A580nm的平均数,B3代表第3次所测A580nm的平均数。1.8抑菌效率检测经初筛计算抑菌效率后,对所有抑菌效率达50%以上的高活性药物样品进行复筛。复筛程序基本同上。在96孔板每排从第2列到第6列,以及从第7列到第11列,将每个活性药物样品的浓度稀释成5个梯度,依次为10,1,1×10-1,1×10-2,1×10-3μg·mL-1,以检测药物样品是否呈现一定的量效曲线。复筛程序重复3次。对3种真菌抑菌效率均达50%以上的药物样品,定义为广谱性抗真菌药物;只对两株白色念珠菌抑菌效率达50%以上的药物样品,暂定为专一抗白色念珠菌药物;仅对白色念珠菌4-1抑菌效率达50%以上的药物样品,定义为白色念珠菌4-1特异性抑制剂。2结果2.1生长曲线特征Fluostargalaxy光学仪根据所记录的A580nm直接作的12个生长曲线图,见图1。由图1可见每个生长曲线图由5个点组成,每个点对应一定培养时间的A580nm,其中第1个点对应的培养时间为2.5h,其他的4个点对应的培养时间依次为3.5,4.5,5.5,6.5h(第1个孔A1,由于软件误差只显示了后面3个点)。3种菌株在起始A580nm为0.02和0.05时,在30℃培养6.5h的过程中,生长都比较缓慢;白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1的生长曲线向里凹,即斜率在逐步增加,说明到后期生长才开始加速,而啤酒酵母a161I°II°在这段时间的生长曲线近乎水平,生长最缓慢。而在起始A580nm为0.1时,3种菌株的生长速度大大升高,生长曲线都近似直线,斜率最大,说明生长最为旺盛。当起始A580nm升到0.2时,3种菌株在最后2h,生长曲线向外凸出,斜率逐渐降低,表明生长速度渐趋缓慢。由此看来,在总体积为100μL,时间为6.5h的培养过程中,不同起始A580nm的菌液的生长状态也各不相同。由图可知,当菌液的起始A580nm为0.1时,真菌生长和分裂的速度达到最大,代谢最活跃。因此我们将筛选时菌液的起始A580nm定为0.1。2.2抑菌活性药物的筛选在经过1次初筛和3次复筛的统计分析之后,发现初筛结果与复筛结果都基本一致。第1次复筛后的分析统计结果见表1。共发现了23种有活性的潜在抗真菌药物,其中有抗白色念珠菌4-1特异性药物1种,即药物样品S-3,它对含Ⅰ型内含子核酶的白色念珠菌4-1的抑菌效率高达98.02%,而对不含Ⅰ型内含子的白色念珠菌62-1和啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的抑菌效率分别只有-1.67%和1.18%。因为后两者与前者的共同区别是不含Ⅰ型内含子核酶,所以该活性药物样品的分子靶标很可能是I型内含子核酶。在所发现的4种抗白色念珠菌药物,包括药物样品S-1,S-2,S-4和S-19等,其中样品S-19抑制白色念珠菌生长的特异性最强。在所发现的18种广谱性抗真菌药物中,有个别药物的抑制效果仍然有轻微的菌珠差异性,可能反应菌珠基因组和个体代谢的不同。在表1中,如果药物样品的抑菌效率为负值,表示它促进真菌细胞的生长。作为正对照的pentamidine在50μmol·L-1时,对白色念珠菌4-1的抑制率为62%,对白色念珠菌62-1的抑制率为28%,对啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的生长无影响;而大蒜油注射液在1∶200的稀释浓度时对3种菌株均有少量抑制。很显然,本实验所筛出的活性药物样品S-3对含有Ⅰ型内含子核酶的菌珠的抑制特异性比pentamidine要强很多。2.3活性成分s-19的浓度在所筛选出的23种活性样品中,有13种样品对3种菌株都呈稳定的量效曲线。即随着药物样品的浓度逐步降低,它们对3种菌株的抑菌率也相应地下降。活性样品S-19在不同浓度梯度时抑制3种真菌生长的量-效曲线见图2。随着活性样品S-19的浓度从10,1,0.1,0.01,0.001μg·mL-1依次降低时,它对白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1抑菌效率也随着下降,呈稳定的量-效曲线。但对啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°只在浓度为10μg·mL-1时呈现少许抑制作用,而当它的浓度降得更低时则促进啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的生长,表明此药物的毒性可能不大。而且从图2可以看出,它对两株基因型不同的白色念珠菌的抑菌效率并无明显差异,表明它抑制两株白色念珠菌生长的分子靶标应该相同,极有潜力发展为抗白色念珠菌的药物。但具体的分子作用机制尚待进一步研究。3s-3活性药物的筛选在本研究的筛选体系中,由于筛选时3种菌液的起始A580nm高达0.1,而培养时间比较短,只有6h,所以即便空气中含有极微量的杂菌,也很难在温度为30℃静止培养时间为6h的条件下长起来,这样减少了因空气中杂菌污染所造成实验困难的可能性。实验结果证明96孔板中4个负对照的A580nm在整个培养过程中无明显升高,说明负对照在筛选过程中不存在明显的污染问题。而且6h的培养时间可以足够使有效的样品发挥抑菌活性。这样每天大约可以筛选3000种药物样品,加快了筛选的速度。并且,由于筛选时菌液的起始A580nm高达0.1,所筛选出的活性药物样品可能适合于深度和中度真菌感染的治疗。本研究所用的抗真菌药物筛选模型,唯有白色念珠菌4-1含有Ⅰ型内含子核酶,其他两个菌株不含。我们发现药物样品S-3强烈抑制含有Ⅰ型内含子核酶的白色念珠菌4-1的生长而对不含此核酶的白色念珠菌62-1和啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的生长基本没有影响,暗示S-3所作用的分子靶标非常专一,是白色念珠菌4-1特有的。尽管除了Ⅰ型内含子核酶以外,白色念珠菌4-1与另外两株菌株在基因型上可能存在其他差异,但这种可能性应该是微乎其微的。因此,我们推测样品S-3的分子靶标可能是Ⅰ型内含子核酶,当然进一步的实验证据还是很必要的。如果S-3被开发成临床药物,其不良反应很小。作为核酶抑制剂的戊脘脒(pentamidine)对白色念珠菌4-1的生长抑制比白色念珠菌62-1要强一些,我们发现S-3对白色念珠菌4-1的特异性比戊脘脒要强很多,说明S-3在体内的分子靶标专一性比pentamidine要强。因为所有的Ⅰ型内含子核酶都有相似的催化核心结构并催化同样的反应,白色念珠菌Ⅰ型内含子核酶的抑制剂很有可能对其他Ⅰ型内含子核酶,比如其他病源念珠菌和卡氏肺囊虫的Ⅰ型内含子核酶均有效。因此,S-3是一种很值得进一步研究和开发的专一性抗真菌药物。本研究发现有4种药物样品抑制白色念珠菌生长呈现较强特异性,而对啤酒酵母生长只呈轻微抑制作用。由于白色念珠菌是机遇型致病真菌,啤酒酵母是非致病真菌,所以这4种药物的抑菌分子靶标很可能与白色念珠菌的致病基因相关,可能也会抑制那些与白色念珠菌类似的其他致病真菌的生长。因为靶标的专一性强,这些活性样品的毒性应该不大。对这些白色念珠菌特异性的抑制药物的抑菌机制、适用范围、和药效等均需要进一步研究。因为白色念珠菌与啤酒酵母在分子水平