超声波辅助提取啤酒废酵母中的adh

超声波辅助提取啤酒废酵母中的adh

0基于啤酒废酵母的adh提取工艺乙醇脱氢酶（adh）是氧化还原酶的第一个亚类，与-参考文献相对应。它以钠d和钠d或pq为酶，以十二烷基硫酸钠和乙酰胺之间的反应。这是一种含有锌的酶。广泛应用于化工、医药、食品等行业。目前，商品adh主要来自动物肝脏，提取和提取过程相对成熟，但其资源有限、价格昂贵，无法满足市场的需求。啤酒厂废弃的啤酒酵母中含有大量sdh。在这项工作中，我们主要研究了从啤酒中提取sdh的过程，并为扩建adh的来源提供了一种新的方法。降低adh的生产成本。1材料和方法1.1材料和设备(1)啤酒垃圾由西安汉斯啤酒厂提供.(2)药物试剂辅酶Ⅰ(NAD+)(Sigma公司生产),磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇等均为分析纯试剂.(3)仪器、仪器和仪器HH-2超声波细胞粉碎机(国华电器有限公司)、TGL-16G台式离心机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、UV-9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)等.1.2实验方法1.2.1adh酶活力测定ADH活性测定采用Vallec-Hoch法.将0.1mLADH酶液与3mLpH为8.5的磷酸盐缓冲液混合,于37℃水浴预热5min,然后加入0.4mL的2M乙醇和0.1mL的4.5mMNAD+溶液,37℃水浴反应5min,立即置于沸水中灭活,于340nm波长处检测吸光度值.空白对照用蒸馏水代替加NAD+,其余均相同.ADH酶活力(U/mL)定义:将ADH在37℃每分钟氧化乙醇脱氢生成乙醛,即还原NAD+为NADH,在340nm处测定的吸光度变化0.001作为一个活力单位(U).1.2.2超声辅助破碎细胞啤酒废酵母经反复冻融后离心浓缩,与一定体积的磷酸盐缓冲液混合,再在低于4℃的条件下采用超声波辅助的方法进行细胞破碎,每超声1s间歇3s,10000r/min离心15min,上清液在340nm波长处测定吸光度值,计算ADH活力.1.2.3adh活力指标在ADH提取实验中,固定其他条件,以提取液中ADH活力为指标,分别对料液比、样品处理量、提取液pH、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度进行考察,以确定各影响因素的适宜水平.1.2.4正交试验设计在单因素实验的基础上,选择对ADH提取效果影响较大的因素,以提取液中ADH活力为指标,按照正交试验原理进行正交设计,每个水平设3个重复,对正交试验结果进行直观分析和极差分析,以确定啤酒废酵母中ADH提取的最优方案.2结果与讨论2.1不同因素对提议废除啤酒废物中的adh活性的影响2.1.1料液比例的确定在细胞超声破碎工艺中,提取液用量一般为样品处理量的3～5倍.但本实验通过对不同料液比下所得的ADH活力进行比较,最终确定以啤酒废酵母量(w)∶提取液(v)为1∶2较为适宜.主要是由于实验所用材料为啤酒厂废弃的啤酒酵母,成分比较复杂,酵母菌体数量相对较少.选用较高的料液比例有利于提高单位提取液中ADH的含量.2.1.2超声辅助提取分别取10g和20g啤酒废酵母,按照1∶2的比例用pH为8.5的0.01mol/L磷酸盐缓冲液对ADH进行超声辅助提取,超声波功率250W,超声全程时间10min.提取液中ADH活力的测定结果见表1.由表1可以看出,采用10g和20g啤酒废酵母在相同条件下进行超声辅助提取时,ADH活力分别为350U/mL和466U/mL,后者不仅提取出的ADH活性高,而且一次可以获得较多的粗酶液,故后续实验中均采用20g的样品处理量.2.1.3提取液中adh活性测定取20g啤酒废酵母,用不同pH的磷酸盐缓冲液对ADH进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中ADH活性测定结果如图1所示.由实验结果可知,啤酒废酵母中ADH提取的适宜缓冲液pH范围为8.5～9.5,在此范围内ADH活性最高,升高或降低缓冲液的pH值均可导致ADH活力降低.2.1.4adh活性测定将20g啤酒废酵母用pH为8.5的磷酸盐缓冲液在不同功率的超声波下进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中ADH活性测定结果如图2所示.由实验结果可知,适宜于啤酒废酵母中ADH提取的超声功率在320W左右.超声波功率不同,ADH的提取结果差异较大.ADH为胞内酶,较低的超声波功率无法实现啤酒酵母细胞的充分破碎,ADH不能完全释放出来.但若超声波功率太大,则产生的高温会对ADH的活性造成影响,故在后续的ADH提取工艺中超声波功率选定为320W.2.1.5超声时间对adh活性的影响将20g啤酒废酵母采用功率为320W的超声波按不同处理时间进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中ADH活力的测定结果如图3所示.由实验结果可知,超声处理全程时间不同时ADH的提取结果也有所不同,处理时间过短不利于酵母细胞完全破碎,处理时间过长则会产热升温而使ADH活性降低,比较适宜的超声全程时间在10min左右.故在后续的ADH提取工艺中,采用功率为320W的超声波在全程时间10min下进行实验.2.1.6adh活性测定选用不同浓度的缓冲液,在功率为320W的超声波下全程处理10min对20g啤酒废酵母进行提取,其他条件同2.1.2,ADH活性测定结果如图4所示.由实验结果可知,在所选的提取液浓度范围内,ADH的提取效果随着提取液浓度的增加而升高,但最终确定提取液浓度以0.08mol/L较为适宜.考虑到温度较高时ADH活力下降较快,故整个提取过程是在冰浴状态下进行的,以维持提取液温度在4℃以下.由于0.08mol/L磷酸盐缓冲液在4℃以下时已接近饱和,因此继续提高提取液浓度对提取ADH意义不大.2.2adh活力测定根据单因素实验结果,以提取液pH、超声波功率和超声全程时间为影响因素,提取液中ADH活力为考察指标,设计了L9(33)正交试验,实验结果见表2.2.2.1adh提取的最优方案由正交试验表极差分析所得的极差值R的大小可以看出,3个因素对ADH提取效果的影响大小依次为A>B>C,即提取液pH>超声波功率>超声全程时间.比较正交表中各列的位级值大小可以得出ADH提取的最优方案为A1B2C1,即提取液pH为8.5、超声波功率为320W、超声全程时间为10min.但此方案并未出现在上述正交表中,故需对其进行验证性实验.2.2.2adh活性测定取20g啤酒废酵母,加入pH为8.5的0.08mol/L磷酸盐缓冲液40mL,超声波功率为320W,每超声1s间歇3s,超声全程时间10min,操作温度控制在4℃以下.经3次重复实验,测得提取液中ADH活力平均值为1806U/mL,高于正交表中的最高值1778U/mL,可见极差分析得到的提取方案可以作为啤酒废酵母中ADH提取的最优方案.3超声辅助提取啤酒废酵母(1)运用超声辅助的方法对啤酒废酵母中的ADH进行提取,得到的最优工艺条件为:20g啤酒废酵母中加入pH为8.5的0.08mol/L磷酸盐缓冲液40mL,采用的超声波功率为320W,每超声1s间歇3s,超声全程时间为10min,操作温度控制在4℃以下.在此条件下,获得的提取液中ADH活性最高,可以达到1806U/mL.(2)研究表明,ADH在温度较高时活力容易损失,故ADH提取过程宜在低温下进行.将细胞冻融破碎法与超声辅助提取工艺相结合用于啤酒废酵母中ADH的提取,既可减少高温对ADH活性的影