啤酒酵母细胞壁中磷酸酯类化学成分的提取与结构

啤酒酵母细胞壁中磷酸酯类化学成分的提取与结构

20世纪40年代，皮尔曼博士首次发现并报道了关于改进海水温度的药物。后来，通过美国图伦大学的进一步研究，发现缩短母系膜的阻力物质是-（1,3）-d-葡萄糖。β-(1,3)-D-葡聚糖是一种极富生物活性免疫多糖,已证实对肿瘤、肝炎、糖尿病、心血管、高血脂等病症都有治疗效果。由于其具灵芝、灰树花、香菇多糖功效结构,因此被有些科学家称为“超级灵芝”,是一种极具发展前景微生物多糖。2006年我国啤酒产量3,515万千升,可得干燥啤酒酵母5万多吨,啤酒酵母细胞壁中含有大量β-(1,3)-D-葡聚糖,约占酵母细胞壁干重45%。目前日本、美国等国都对其进行大量深入研究,已将提取出β-(1,3)-D-葡聚糖广泛应用于医药、食品、水产品养殖、化妆品等领域。我国废酵母泥大多被作为廉价粗饲料处理或直接排放,造成很大资源浪费和环境污染。因此,寻求和优化一种高效提取方法,对于进一步提高β-(1,3)-D-葡聚糖产量和品质,减少资源浪费和环境污染,创建节约型和谐社会具有非常重要意义。1碱溶性葡聚糖电子显微镜观察显示,啤酒酵母细胞壁有三层结构,最外层是甘露聚糖,中间是蛋白质,最内层是β-葡聚糖,层与层之间可部分镶嵌(见图1)。甘露聚糖是高度分支多聚体,以α-(1,6)键合D-甘露聚糖为主链,同中间层蛋白质和磷酸酯连在一起形成磷酸甘露聚糖-蛋白质复合物。该复合物中蛋白质具有一定特性,苏氨酸和丝氨酸含量较高。甘露聚糖大量碳水化合物短链与多肽残基上羟基结合,形成O-糖苷键,该键在碱性条件下很稳定,不易断裂。又由于与甘露聚糖相连多肽为碱溶性,因此该复合物能以整体形式溶于碱性溶液中。O-糖苷键在酸性条件下不稳定,易分解成甘露聚糖和蛋白质两个独立成分,而这两种成分在弱酸性条件下不溶于水。若使用强酸,则易造成葡聚糖大量分解。因此,通过研究外层复合物结构性质,可合理制定提取工艺。在提取β-(1,3)-D-葡聚糖过程中,不仅要研究外层复合物,还要清楚内层提取物结构性质。Bacon于1969年提出酵母葡聚糖是由以β-(1,3)-D-葡聚糖为主链,β-(1,6)-D-葡聚糖为辅组成。Manmers等于1973年提出85%碱不溶性葡聚糖是由β-(1,3)键连接,同时穿插3%β-(1,6)葡聚糖苷键。Kopecka等于1974年应用从环状芽孢杆菌中提取纯化内-β-(1,3)-D-葡聚糖酶和内-β-(1,6)葡聚糖酶消化细胞壁,暴露出细胞壁内层纤维层,得出内层主要为β-(1,3)-D-葡聚糖这一结论。在葡聚糖与其它物质连接中,Kapteyn于1997年提出β-(1,6)葡聚糖链首先附着于细胞壁蛋白上葡萄糖磷脂酰肌醇(GPI)结合位点末端,而后这些β-(1,6)葡萄糖基化的甘露糖蛋白又交联到β-(1,3)-D-葡聚糖网络中。酵母细胞壁中葡聚糖分为碱不溶性、碱溶性、酸溶性三种。碱不溶性葡聚糖是以β-(1,3)-D-葡聚糖为主链含有β-(1,6)分支的葡聚糖;碱溶性葡聚糖是指β-(1,3)-D-葡聚糖;酸不溶性葡聚糖是以β-(1,6)-D-葡聚糖为主链,中间插有β-(1,3)键的葡聚糖。2超声波提取法目前,国内外对酵母细胞壁葡聚糖提取方法较多,主要有酸法提取、碱法提取、酸碱一体法、有机溶剂提取、超声波提取、酶法等。各种方法各有利弊,优缺点明显。2.1离心除杂、脱色称取干燥后啤酒酵母渣,加入0.5mol/L乙酸溶液,在50℃下反应3h,离心处理,沉淀物水洗2次,然后用无水乙醇洗涤脱色,无水乙醚洗涤脱水,喷雾干燥即可。李祥等(2004)运用该法研究发现,实验得到是酸不溶性葡聚糖,多糖得率比碱法高;但产品中蛋白质、甘露聚糖等杂质含量多,需进一步纯化,工艺复杂。2.2乙醇制备工艺准确称取啤酒干酵母,加入1mol/L氢氧化钠溶液,在90℃下水解反应3h,水解液过滤,沉淀物水洗2次,然后用无水乙醇洗涤脱色,无水乙醚洗涤脱水,喷雾干燥即可。廖鲜艳等(2001)对此工艺进行分析,得到较优碱处理组合:第一次条件,氢氧化钠浓度3%,添加量6v/w(液固比),作用温度75℃,作用时间3h;第二次条件,氢氧化钠浓度3%,添加量4v/w,作用温度100℃,作用时间2h。该法得到是碱不溶性葡聚糖,多糖得率低:但杂质含量少,污染较大,耗能较高。2.3-1,3,4-三-葡聚糖的制备称取啤酒干酵母粉,加入1mol/L氢氧化钠溶液,添加量为20v/w(液固比),75℃下水解反应3h,冷却至室温,经4000r/min离心5min,沉淀物水洗2次,再用4%乙酸溶液200ml室温下处理沉淀物2h,离心;沉淀物水洗2次,无水乙醇脱色,无水乙醚脱水,喷雾干燥即可。黄刚良等(2003)运用该法与酸法提取进行比较,发现酸碱法是提取β-(1,3)-D-葡聚糖理想途径,得到葡聚糖纯度较高,质量较好;但该过程葡聚糖分子降解较明显。2.4葡聚糖分散液制备法废酵母泥处理并自溶,4000r/min离心分离,沉淀物用中性蛋白酶57℃处理24h,再离心分离,沉淀物加入2%氢氧化钠在60℃下处理3.5h后,离心、水洗、去脂、干燥。赵光远等(1997)用此工艺进行研究,认为该法葡聚糖纯度较高,尤其是蛋白质含量低;但能耗较高,污染大。2.5葡聚糖提取法称取100g啤酒酵母泥,加入50ml蒸馏水进行超声波处理,条件为功率400W,温度20℃,超声时间5s,全程时间20min,无间隔时间,处理后冷却至室温,4000r/min条件离心15min,沉淀物用蒸馏水洗涤,无水乙醇脱色,无水乙醚脱水,在37℃条件下干燥12h后得到产品。张开诚(2004)运用该法研究认为,超声波法提取葡聚糖工艺简便,成本低廉,收率较高,提取后废液不含酸碱,对环境污染较酸碱法要小;但其产品纯度不高,还需进一步研究优化提取条件,提高产品纯度。在工业化生产中,可根据不同生产目的采用不同工艺流程,如酸法由于产量大、纯度低,特别适于饲料添加剂生产,其葡聚糖产品可用于鱼、鸡等饲料中;碱法或酸碱法产品可用作营养保健品、化妆品等添加剂;而酶-碱法由于其纯度较高,可用于进一步葡聚糖深加工,如医药级、化学试剂等。超声波法由于超声设备等不是很成熟,目前仅停留在实验室阶段。3brms在免疫系统中的应用酵母β-(1,3)-D-葡聚糖是一种良好生物效应调节剂(BRMs),它能通过刺激免疫系统而提高机体免疫能力,BRMs在相互依赖机体系统中,对维持体内平衡非常关键(如神经系统、内分泌系统、免疫系统),能帮助机体适应环境和心理压力。但人体自身无法合成β-(1,3)-D-葡聚糖,因此将它们成功分离提取,以用于抗真菌治疗具有重要意义。3.1氨基酸c-d-葡萄糖的药理学应用3.1.1活性化合物质构利用分子力学(MM2)计算二糖结构单元全局最低能量现象,并进行分子几何全优化,表明能量最低构象为单螺旋结构,且多羟基基团位于螺旋表面,因此该种构象是刺激免疫和抗肿瘤活性基础。且多糖骨架链上占优势的交替(1,3)键连接,且具有(1,6)键分支β-葡聚糖更有明显抗肿瘤活性。经X-衍射和核磁共振分析证明,具有三个螺旋构象β-(1,3)-D-葡聚糖上多羟基基团是抗肿瘤活性靶点,能增强肌体免疫活性,起到预防和治疗癌症作用。3.1.2-1,3-d-葡聚糖微粒从某种程度上讲,由于其不是人体中存在物质,因而能显著刺激并提高免疫体活性。β-(1,3)-D-葡聚糖微粒通过与巨噬细胞结合进而触发免疫机制,从而诱导骨髓白细胞产生大量巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞攻击并吞噬有害入侵物;动员免疫细胞运动到异物处,提高巨噬细胞吞噬能力,并把命令传递给下一个免疫系统。3.1.3添加-1,3,3-d-葡聚糖对大鼠血清愈伤组织的影响可作为皮肤临时替代物促进伤口愈合,由于巨噬细胞活性在外科和伤口愈合上起到重要作用,因此添加β-(1,3)-D-葡聚糖能增强抗感染能力,增强愈伤组织能力,强化愈伤组织发挥作用。3.1.4其他方面β-(1,3)-D-葡聚糖可降低胆固醇效应;增强机体抗辐射及降低血脂作用;可用作药物缓释系统。3.2作为食品添加剂β-(1,3)-D-葡聚糖能改善食品质地,可用作食品增稠剂、脂肪替代物,还可作为食品中膳食纤维来源,是一种非常优良食品添加剂,具有很大发展前景。3.3葡聚糖特异性受体β-(1,3)-D-葡聚糖能增强水产动物非特异性免疫系统,水产动物机体内巨噬细胞表面上存在着一个β-(1,3)-D-葡聚糖特异受体,当β-(1,3)-D-葡聚糖与巨噬细胞结合后,激活巨噬细胞活性,通过吞噬作用吸收、破坏和清除体内病原微生物,提高水产动物免疫功能。β-(1,3)-D-葡聚糖在水产养殖中可减少水产动物,尤其是鱼、虾病害,在水产动物饲料中添加葡聚糖会大大增加水产动物对疾病抵抗力。3.4遗传物质起核心作用β-(1,3)-D-葡聚糖可作为生命活动中起核心作用遗传物质,能控制细胞分裂和分化,将其添加到化妆品中,可利用其免疫调节活性促进皮肤再生,调节细胞生长,从而达到抗衰老作用。4加强微生物酶活性研究我国是啤酒生产大国,有着巨大废啤酒酵母资源,因此,优化现有生产工艺,探求新的提取技术,在节能降耗和减少环境污染基础上,得到高品质β-(1,3)-D-葡聚糖具有重大意义。加强甘露聚糖及其与