细胞工程制药技术 植物细胞培养技术

生化制药工艺项目四

细胞工程制药技术1细胞融合2植物细胞培养技术3动物细胞培养技术目录CONTENTS02植物细胞培养技术Part2植物细胞培养技术一、植物细胞的全能性1、植物细胞的全能性细胞全能性为细胞的某种特征，有这种能力的细胞可保留形成有机体

所有的细胞类型的能力----1984年国际组织培养协会全能细胞是能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同的生物体德国植物学家Haberlandt1902年预言“植物细胞具有全能性”。不久Hanning成功地在培养基上培育出正常发育的萝卜和辣根菜的胚。称为植物组织培养的鼻祖Haberlandt（1854-1945）Part2植物细胞培养技术一、植物细胞的全能性2、植物培养相关概念植物组织培养（tissueculture）/试管植物/离体培养在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生质体，培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等，或者长成新的完整植株一种实验技术植物细胞培养（cellculture）离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术两者区别：是否形成组织Part2植物细胞培养技术一、植物细胞的全能性2、植物培养相关概念外植体（explant）进行植物细胞培养所选取的植物部分愈伤组织（callus）由外植体的增生细胞产生的脱分化的植物细胞团脱分化（dedifferentiation）指植物离体器官、组织、细胞在人工培养液上，经过多次细胞分裂而失去原来的分化状态形成无结构的愈伤组织或细胞团的过程，使其回复到胚性细胞的状态再分化（redifferentiation）指离体培养的植物组织或细胞可以由脱分化状态再度分化成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整植株Part2植物细胞培养技术一、植物细胞的全能性3、植物组织/细胞培养的意义植物中含有丰富的次生代谢物质，有25%的法定药物来自植物，规模化植物细胞培养以提取天然产物是解决此瓶颈的有前途的方法珍贵植物和名贵花草等种苗的快速繁殖植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的研究红豆杉紫杉醇据有关专家估计，全世界每年需要500kg紫杉醇才能满足广大癌症患者的需求。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若仅从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。红豆杉细胞培养具有如下特点可能会成为能够解决紫杉醇长期供应问题的非常有希望的手段：细胞培养过程都有效控制，不受地理环境、病虫害和季节等因素的影响，保证产物无限、连续、均匀地生产可以进行红豆杉细胞的筛选和培养条件的优化而获得超过原植株紫杉醇含量的细胞和培养条件易于在生物反应器中大规模、高密度地培养。减少占用可耕地面积，降低生产成本和提高生产率。利用现有的或探索新的生物技术进行红豆杉细胞紫杉醇代谢途径和规律的研究，使细胞定向合成次生代谢物Part2植物细胞培养技术二、植物组织培养1、植物组织培养的要求用于培养的外植体细胞必须具有全能性离体隔离适宜的培养条件环境条件：光照、温度、湿度（1）光照表现在光强、光质、光照时间方面光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。一般光照强度为1000~5000lx光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。光质，对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响Part2植物细胞培养技术二、植物组织培养1、植物组织培养的要求适宜的培养条件环境条件：光照、温度、湿度（2）温度大多数植物组织培养都是在23-27℃之间进行，一般采用25土2℃（3）湿度容器内相对湿度要保持在99%左右，环境的要求70％-80％（4）渗透压培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用（5）通气氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料固体培养基→活性炭；液体培养基→振荡Part2植物细胞培养技术二、植物组织培养1、植物组织培养的要求适宜的培养条件营养条件无机盐类大量元素：C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg微量元素：Mo、Co、Mn、Cu、Zn、Fe等无机盐对非洲紫罗兰组织培养的影响Part2植物细胞培养技术二、植物组织培养营养条件有机营养碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖蔗糖浓度：使用量1-5%，常用量为2-3%，幼胚培养可提高到4-15%蔗糖具有热易变性，高压灭菌后部分糖会分解蔗糖在培养基中的作用为培养物提供能源和碳骨架可以调节培养基的渗透压氮源氨基酸类、酰胺类碳源浓度对非洲紫罗兰组织培养的影响Part2植物细胞培养技术二、植物组织培养营养条件活性物质维生素类、肌醇、生物素等

Auxins----生长素诱导细胞的分裂和根的分化Cytokinins----细胞分裂素促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官，分化不定芽生长素浓度对非洲紫罗兰组织培养的影响细胞分裂素浓度对非洲紫罗兰组织培养的影响Part2植物细胞培养技术二、植物组织培养营养条件活性物质生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向（形成愈伤组织；长根；长芽）

高：有利于根、愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素适中：有利于根芽的分化

低：有利于芽的形成Part2植物细胞培养技术二、植物组织培养2、组织培养的培养基MS培养基无机盐浓度高、元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，是目前使用最广泛的培养基White培养基无机盐、有机成分含量较低，适用于生根培养B5培养基含较高的NO3-N，氨态氮含量较低，含有较高的硫胺素（VB1）较适用于一些要求较高氮素营养的植物培养，如常见木本植物双子叶植物组培的选择N6培养基成分简单，KNO3

和(NH4)2SO4含量高，适合花药培养,尤其适合禾本科植物的组织培养Part2植物细胞培养技术二、植物的组织培养2、组织培养的培养基母液配制与保存配制母液可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度高10-100倍的母液，低温保藏培养基的配制加入蔗糖并充分溶解→定容→调pH值→加琼脂→分装封囗→灭菌不同植物的最适pH值Part2植物细胞培养技术二、植物的组织培养3、组织培养操作无菌培养体系的建立与增殖外植体的选择、灭菌、接种、培养外植体的脱分化----愈伤组织诱导

器官发生、生根与试管苗的移植离体器官发生:指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）、类原球茎（PLBs）等器官的过程对于上述途径所获得的芽，在大多数情况下均需要转移到生根培养进行生根诱导发育成完整植株生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度试管苗的移植移栽前将培养物不开口，移到自然